При постройке госпиталя архитектором Ф. И. Демерцовым в нём был создан отдельный храм, оформленный снаружи портиком. Он занимал середину второго этажа и завершался глухим высоким куполом с крестом. Иконы в двухъярусном золочёном иконостасе были написаны на холсте. Работы по отделке храма начались в ноябре 1799, а уже 18 июня следующего года состоялось его торжественное освящение.
Очень скоро стало очевидно, что созданное медицинское учреждение слишком велико для одного Семёновского полка. Госпиталь на 300 мест, выстроенный в «знак признательности Императора Павла I» на средства наследника великого князя Александра Павловича, стал общим – гвардейским. Высокий профессиональный уровень медицинского состава госпиталя, его просторные и удобные помещения позволили разместить здесь в период Отечественной войны 1812 года не только раненых и больных Семёновского полка, но и других гвардейских частей. Именно с этих пор госпиталь сделался достоянием четырёх полков: Семёновского, Измайловского, лейб-Егерского и Московского, а впоследствии и школы гвардейских подпрапорщиков. Со временем госпиталь стал ориентироваться на обслуживание ещё большего числа других гвардейских частей, не отказывал в медицинской помощи и гражданскому населению столицы. Благодаря вниманию шефа полка, императора Александра I, период 1805–1820 годов стал наиболее благоприятным в истории госпиталя. На его нужды выделялись значительные дополнительные средства. В 1815 году при непосредственном участии командира полка генерал-майора Я. А. Потёмкина на территории госпиталя в одном из флигелей был создан родильный покой, что позволило заметно снизить высокую смертность среди новорождённых в семьях военнослужащих полка.
Как отмечал в 1820 году доктор медицины Г. Л. фон Аттенгофер, «Госпиталь для полка Императорской гвардии по своему внутреннему и внешнему устройству превосходит все прочие заведения. Он в своём роде представляет образец совершенства. Не знаю, должно ли более удивляться истинно великолепным больничным залам, чистым и красивым постелям и покойной одежде больных воинов, или дивиться точности и порядку в хождении за недужными, наилучшим образом приготовленной для них пище и попечительности медиков».
Нижний этаж здания занимали полковая и казначейская канцелярия, архив, команда писарей и полковая прислуга, полковая библиотека. Для способных полковых кантонистов в 1823 году при госпитале была организована фельдшерская школа, носившая название «Класс лекарских помощников». В школе преподавали латинский язык, обучали теоретической и практической анатомии, правилам наложения повязок и выполнению простейших операций.
На базе госпиталя неоднократно происходили испытания действия различных лекарственных средств и хирургических принадлежностей. Во время эпидемии холеры в 1831 году в госпитале были проведены экспериментальные способы её лечения. В стенах госпиталя был осуществлён целый ряд редких операций. 26 июля (7 августа) 1844 году в госпитале была проведена труднейшая операция по перевязке общей сонной артерии – одна из первых в России, осуществил её медико-хирург Карачаров П. И., на операции присутствовали И. В. Буяльский, П. А. Дубовицкий, Н. А. Наранович. Врачи госпиталя поддерживали связь с ведущими специалистами Медико-Хирургической академии и других лечебных заведений Петербурга, широко использовали достижения европейской медицины.
В разное время в госпитале работали П. П. Евланов, Н. Н. Иванов, К. К. Рейер, Э. К. Росси, К. А. Шенк, С. М. Янович-Чаинский и другие. В клиниках госпиталя проводили консультации С. П. Боткин, И. О. Коржевский, Е. В. Павлов. В периоды боевых действий госпитальные врачи входили в состав медицинских формирований, направлявшихся в действующую армию.
Госпитальный храм, с 1869 года уже независимый от полка, сохранился даже тогда, когда рядом с ним выросла полковая Введенская церковь. В 1841 году над домовой церковью был надстроен третий этаж и одновременно убран купол. Возможно, тогда же на крыше здания сделали деревянную звонницу. В 1901 году в храме была освящена Голгофа, устроенная на пожертвования А. М. Латышева, и поставлена в золочёном киоте икона Божией Матери «Всех скорбящих радости», написанная в мастерской Ф. Е. Егорова. Дни кончины Императоров Александра I и Александра II отмечались в храме панихидой. Церковь была приписана к Введенскому собору лейб-гвардии Семёновского полка, но в декабре 1916 года стала приходской. По требованию новых властей в январе 1921 года церковь закрыли, а через три года окончательно ликвидировали.
В 1918 году госпиталь переименовали в Петроградский Семёновский, а затем в Петроградский военный госпиталь №2. В 1923–1924 годах он носил имя председателя РВС Республики Л. Д. Троцкого. Госпиталь просуществовал в таком виде до 1930 года, после чего был расформирован, а его здания и всю прилегающую территорию передали Школе военных лекарских помощников, впоследствии преобразованной в Военно-медицинское училище им. Н. А. Щорса.