Большой урон монастырю принесла секуляризация (отчуждение) церковных и монастырских земель, начатая по инициативе императрицы Екатерины II. В 1764 г. в нем по штату оставили 33 монаха и послушника, почти все монастырские земли отторгли. Еще один сильный урон монастырю нанесли французы: в 1812 г. наполеоновские войска фактически сожгли его. И все-таки монастырь всегда выживал и возрождался. Так было и после лет советского периода. В 1923 г. Пафнутьевский монастырь закрыли, фактически все его церковные ценности были украдены, известно, что кое-что из имущества богатого монастыря было «передано» Главмузею, а потом делось в большой мере неизвестно куда. В закрытом монастыре разместили вначале музей, а затем – исправительно-трудовую колонию для преступников, а еще позже – сельскохозяйственный техникум. В монастыре еще в середине 1930-х гг. был музей, затем его перевели в Боровск, где он существовал около 20 лет. Многое из монастырских исторических строений было утрачено, повреждено или искажено перестройками. Так, в 1930-х гг. был утрачен храм Всех Святых, на его месте построили рядовое школьное здание. Во время Великой Отечественной войны 1941–1945 гг. на территории монастыря находились беженцы из оккупированных фашистами областей, а также погорельцы из сожженных и уничтоженных соседних деревень. Отступая, гитлеровская артиллерия обстреливала монастырь, были сильно повреждены его стены и храмовые здания. После освобождения от немецко-фашистской оккупации в монастыре разместили школу трактористов и механизаторов, а с 1956 г. – сельскохозяйственный техникум.
В 1991 г. Пафнутиев Боровский монастырь вернули Русской Православной Церкви, он возродился как мощный религиозный центр. Главными святынями возрожденного монастыря являются святые мощи его основателя – преподобного Пафнутия (пребывающие под спудом в монастырском соборе), древняя икона «Рождество Пресвятой Богородицы», а также древняя реликвия этого монастыря – «Голгофа» (Распятие Иисуса Христа). Кроме того, в монастыре пребывают частицы мощей преподобного Нила Столобенского, благоверной княгини Анны Новгородской, мученика бессребреника Иоанна, преподобного Феофила, благоверной княгини Анны Кашинской, святителя Тихона, Патриарха Московского, преподобного Семиона Верхотурского, святителя Луки Одесского, преподобномученицы великой княгини Елизаветы Федоровны Романовой, преподобного Серафима Саровского, преподобных Оптинских старцев. Теперь в монастыре снова действуют собор в честь Рождества Пресвятой Богородицы (1586), больничный храм в честь святого пророка Божия Илии (1610–1670) в больничных палатах, храм в честь Митрофана, патриарха Константинопольского (1760–1763, 1819) в настоятельском корпусе (ХVII в.).
Кроме того, сохранились 5-ярусная колокольня (ХVI в., 1690, изразцовый декор верхнего яруса выполнен известным мастером С.И. Полубесом), со службами, монашеские корпуса (ХVII в.), трапезная палата с церковью Рождества Христова (1511), служебный корпус, святые ворота, стены (высота 7,5 м, толщина более 4 м, длина 673 м) с 6 башнями (ХVI в. мастер Трофим Шарутин; но ряд исследователей считают, что Поваренную, Оружейную, Георгиевскую башни около 1590 г. построил известный зодчий Федор Конь). Все они после возвращения монастыря РПЦ представляли собой чуть ли не руины, пребывали в ветхом аварийном состоянии, их привели в порядок, отремонтировали, провели тактичную и грамотную реставрацию. В наши дни Пафнутиев Боровский монастырь вновь поражает своими возрожденной красотой и величием. Монастырь имеет свое подворье в Москве (Ипатьевский пер., д. 12) и в Калуге (Преображенский храм на Смоленской ул., д. 8). Теперь в Пафнутиевом монастыре численность монахов и насельников превышает 20 человек.
Около стен Пафнутиев Боровского монастыря находится почитаемый целебный источник Пафнутия Боровского с купальней. Источник почитается как святой. Пафнутьевский монастырь принимает паломников, но только мужского пола. Если прибывают организованные группы, то их прием должен быть согласован с наместником монастыря, период паломнического пребывания в обители разрешен до 7 дней.