На сороковом году своей жизни угодник Божий лишился супруги и тогда же решил отречься от мира, чтобы беспрепятственно служить Богу. Он поселился в Золотниковской пустыни в честь Успения Божией Матери. Здесь в 1663 году священник Михаил был пострижен в иночество с именем Митрофана. К сожалению, ничего не известно о подвигах святого Митрофана в тихой пустыни. Следуя учению Евангелия, он старался скрыть свои подвиги от людских взоров и дал обет окончить жизнь и быть погребенным в Золотниковской пустыни — так ему была дорога мирная сень скромной обители.
Но Господь судил святому Митрофану иной, высший жребий духовного водительства другими. Несмотря на старание подвижника укрыться от славы человеческой, богоугодная жизнь его сделалась известна для окрестного населения: спустя три года по вступлении святого в Золотниковскую обитель братия соседнего Яхромского Космина монастыря, не имевшая в то время настоятеля, обратилась вместе с крестьянами монастырских вотчин с просьбой к духовной власти поставить игуменом их обители известного своей строгой жизнью инока Митрофана. Просьба была исполнена: в июне 1665 года блюстителем патриаршей кафедры митрополитом Сарским и Подонским Павлом инок Митрофан «благословен во игуменский чин». Во всю свою последующую жизнь угодник Божий сильно скорбел, что не мог выполнить обета об безысходном пребывании на месте своего пострижения, хотя он нарушил его не самовольно, а по иноческому послушанию. В Яхромском монастыре святой Митрофан был настоятелем почти десять лет. Насаждая среди братии дух благочестия, святой игумен заботился и о внешнем процветании обители. Вскоре после вступления в управление монастырем он приобрел для него богато украшенное Евангелие; затем, видя тесноту монастырского храма, святой Митрофан с помощью благотворителей соорудил новый, более обширный, во имя Всемилостивого Спаса, Нерукотворенного Его образа, причем снабдил этот храм новой церковной утварью.
В 1675 году управлению святого Митрофана, как «мужа благоговейного и добродетельного», патриарх Иоаким (управлял Русской Церковью с 1674 по 1690 гг.) поручил другую, более обширную и славную Унженскую обитель во имя Живоначальной Троицы. Унженская обитель пользовалась милостью царей дома Романовых. Она была знакома царю Михаилу Феодоровичу еще до вступления его на Российский престол: в 1612 году или начале 1613 года он с матерью своей, инокиней Марфой Иоанновной, приезжал в обитель и молился преподобному Макарию о возвращении отца своего, митрополита Ростовского Филарета, томившегося в плену у поляков. В 1619 году Михаил Феодорович совершил в торжественно–царской обстановке путешествие в монастырь преподобного Макария по своему обету «за некоторые угодника Божия чудеса и помощь, оказанную великому государю и родителем его во время их печали». Со времени царского посещения Унженская обитель, по воле Михаила Феодоровича, была учинена «наравне с Соловецким монастырем», а игумены ее получили право ежегодного приезда в Москву к царю и патриарху с образом преподобного Макария и со святой водой после дней празднования преподобному Макарию, приходившихся на 19 января и 25 июля. Таким путем Унженские игумены получили личный доступ к царю и патриарху, что имело важное значение для обители, особенно в случае каких–либо дел. Не меньшую любовь и веру к преподобному Макарию Унженскому имел и внук царя Михаила, Феодор Алексеевич (царствовал с 1676 г. по 1682 г. Эти годы падают на время управления св. Митрофана Унженской обителью), у которого было сильное желание видеть обитель и поклониться гробу преподобного. Высокое покровительство царствующего дома благоприятно отразилось на внешнем положении обители, которая из малозаметной и немногочисленной становится знаменитой, многолюдной и богатой, обладающей многочисленными вотчинами, обширным и разнообразным хозяйством.
Назначение святого Митрофана игуменом такой обители показывает, как патриарх Иоаким почитал его за благочестие и мудрую распорядительность, и следует признать это тем более, что обстоятельства внутренней жизни обители требовали особенной внимательности при выборе настоятеля ей. Последние годы правления предшественника святого Митрофана, игумена Никиты, были для Унженской обители очень тяжелы. В 1671 году были обретены честные мощи основателя монастыря — преподобного Макария; по распоряжению игумена они были положены в издавна устроенной поверх могилы преподобного гробнице с изображением почившего угодника Божия на верхней доске. Ежегодно начали совершать празднование в память открытия мощей. Но это радостное событие омрачилось печалью: игумен и братия, «содержимые простотою», не сообщили об открытии мощей ни патриарху, ни царю. Через четыре года по доносу одного монаха, недовольного игуменом Никитой, поднялось об этом дело. Начавшееся по распоряжению патриарха следствие окончилось тем, что открытые мощи были положены под спуд, а Никита лишен был игуменства и сослан «под начал в послушники» в Желтоводский монастырь.