Благоговейная любовь к прп. и уважение к святому Митрофану побудили царя Феодора избрать Унженского игумена во епископа новоучрежденной Воронежской епархии. На Московском Соборе 1681–1682 гг. в числе мер для борьбы с усиливавшимся расколом старообрядчества и в целях содействия большему распространению христианского просвещения среди православных положено было увеличить число епархий и между прочим решено открыть новую кафедру — Воронежскую. На эту кафедру, по желание царя, и избран святой Митрофан, еще ранее, года за полтора вызванный из Унженской обители в Москву на чреду священнослужения. Современники объясняют это избрание высокой подвижнической жизнью св. Митрофана, «мужа воистину праведна и свята», а также желанием благочестивого царя возвеличить Унженскую обитель возведением на епископскую кафедру ее настоятеля, в котором он видел наместника преподобного Макария по игуменству и ученика его по жизни.
2 апреля 1682 года святой Митрофан был посвящен в епископа патриархом Иоакимом с шестнадцатью архипастырями. Святителю было тогда 58 лет от роду. После своего посвящения святитель Митрофан прожил довольно продолжительное время в Москве, с апреля до половины августа. Новоучрежденная епархия нуждалась первоначально в его заботах здесь, в столице, где находилась высшая духовная и светская власть: так, в Москве вскоре после хиротонии святой Митрофан возбудил вопрос об отводе места в городе Воронеже под соборную церковь и под двор епископу с домовыми людьми. Кроме того, первопрестольнику Воронежскому нужно было запастись и советами опытных людей, а также приобрести предметы, необходимые для богослужения. Между прочим, из домовой архиерейской казны Рязанского митрополита святому Митрофану были выданы книги, епископское облачение, посох, кресты; из нее же получены им были и деньги.
28 апреля скончался благочестивый царь Феодор Алексеевич, и святитель Митрофан, чередуясь с другими бывшими в Москве епископами, совершал установленное поминовение по усопшем государе. 25–го июня святитель участвовал в венчании на царство юных государей Иоанна и Петра Алексеевичей, причем в числе других священнослужителей поднес патриарху Иоакиму для вручения царям державу.
Лето, проведенное святителем в Москве после хиротонии, было тяжелым временем волнений государственных и церковных. На его глазах происходили кровавые неистовства стрельцов (15, 16 и 17 мая), державших в постоянной тревоге и правительство, и народ в продолжении всего лета 1682 года. Воронежский епископ присутствовал 5 июля на Соборе в грановитой палате, устроенном для прений с раскольниками, и был свидетелем диких проявлений необузданного фанатизма невежественных защитников старины: их предводитель, суздальский поп Никита Пустосвят, не стесняясь присутствием на Соборе правительницы Софии, вдовой царицы Наталии Кирилловны и патриарха, даже нанес побои Холмогорскому архиепископу Афанасию (управлял Холмогорской епархией с 1682 по 1702 гг.), когда тот обратился к нему со словом увещания. Без сомнения, эти печальные события глубоко запали в душу святого Митрофана, и святитель до гроба ревностно заботился как об устроении церковной жизни, так и о благе государственном. Впоследствии он сам напоминал в челобитных государям, что был отпущен из Москвы в Воронеж в «смутное время», почему и архиерейский дом его оставлен в забвении, не имея вотчин и угодий.
Тяжелый подвиг епископского служения для святителя Митрофана увеличивался нестроениями его новоучрежденной епархии. Воронежский край был лишь недавно заселен; город Воронеж еще не насчитывал себе тогда и ста лет (город Воронеж возник в 1586 г.). Первые поселенцы здесь были невольные, согнанные сюда правительством из разных сел и городов России для охраны края от нападений крымских татар; к ним впоследствии присоединились беглецы, покидавшие по тяжелым условиям жизни родные места и искавшие приволья в Придонской Украине; были здесь и выходцы из Приднепровья, укрывавшиеся от польских притеснений. Это разнообразное население Придонского края было подчинено в церковном отношении Рязанским митрополитам, но в действительности оно лишено было епископского руководительства и надзора: при обширности Рязанской епархии, имевшей более 1200 церквей, Рязанские архипастыри едва ли посещали город Воронеж, не говоря уже об уезде, а потому они не могли иметь пастырского влияния на этот отдаленный край своей епархии. Все это печальным образом отражалось на состоянии веры и нравов населения: свет евангельского учения не проник в жизнь народа.