Приведенное послание проникнуто одной мыслью — о величии и святости пастырского служения; ею же проникнуто и последнее обращение к священнослужителям Воронежской епархии, наставление святителя, содержащееся в его духовном завещании. Та же самая мысль одушевляла святителя и во время его двадцатилетней многотрудной архипастырской деятельности. Вступив на Воронежскую кафедру, святой Митрофан самоотверженно возложил на себя нелегкие и сложные обязанности епископа. Как опытный хозяин, радеющий об имуществе церковном, он стремился к тому, чтобы увеличить средства своей небогатой епархии, и заботливо упорядочивал ее внешний, церковно–хозяйственный обиход. Но главные заботы святителя сосредоточивались на пастырском попечении о спасении душ вверенного ему Господом словесного стада. Святой Митрофан явился истинным пастырем, со страхом Божиим он совершал свое служение: с любовью и милосердием вспахивал святитель ниву сердец человеческих, чтобы посеять на них спасительные семена слова Божия; лишь в крайних случаях для искоренения пороков обращался он к суровым карательным мерам.
Неприветливо встретил святого Митрофана его кафедральный город: архиерейский двор оказался настолько ветхим, что старец святитель вынужден был на первых порах ютиться со «своими домовыми людьми» на постоялом дворе, причем, по его собственному выражению, он терпел «большую нужду» — должен был даже покупать себе хлеб. Средства новой епархии, вверенной управлению святого Митрофана, были очень невелики: не считая Воронежа, к ней отошло главным образом из соседней Рязанской митрополии шесть незначительных городков: Елец, Коротояк, Землянский, Урыв, Орлов, Костенской, а между тем на сбор с местных церквей и монастырей нужно было содержать архиерейскую кафедру с «домовыми людьми». За грозными событиями лета 1682 года духовные и светские власти в Москве забыли позаботиться о нуждах новоучрежденной маленькой Воронежской епархии. И святитель впоследствии указывал в челобитных, что он «отпущен из Москвы на Воронеж в смутное время, а ничем не пожалован», почему «на Воронеже, в дому Пресвятыя Богородицы вотчин и никаких угодий нет, и он, Митрофан епископ, ничем не взыскан». Таким образом, перед святителем прежде всего возник вопрос о хозяйственных нуждах епархии. Сам святитель вел настолько простой образ жизни, что ему с избытком хватило бы самых незначительных средств. Но бедность епархии была тяжела ему потому, что обрекала на нужду и всех обитателей его архиерейского дома, что не позволяло ему раздавать щедрую милостыню нищим, что, наконец, препятствовало ввести в епархии благолепное церковное богослужение, к чему особенно лежало сердце святого Митрофана.
Сам по себе тяжелый вопрос о епархиальных средствах для святителя осложнился еще новым неприятным делом: он вынужден был отстаивать границы своей епархии от притязаний Рязанских митрополитов, недовольных выделением из своей митрополии некоторых городов, отошедших к новоучрежденной Воронежской кафедре. Этот спор о границе смежных епархий вызывался отчасти тем, что собором 1674 года было постановлено каждой епархии руководиться при разграничении входящих в ее состав городов и уездов старыми писцовыми книгами, составленными вскоре после Смутного времени. Но потом, когда на Украине, благодаря усиленному приливу переселенцев, с течением времени возник целый ряд новых городков, получилось несоответствие нового деления на уезды со старым по писцовым книгам, которыми все–таки продолжали еще руководиться в делах землевладения и податном. Поводом для начала распри могли послужить случаи добровольного отделения от Рязани некоторых сел, близких к Воронежу или к уездам Воронежской епархии, или наоборот — попытки некоторых приходов Воронежской епархии отписаться к Рязани, причем святой Митрофан принимал меры к возвращению отложившихся приходов. Продолжительный спор святого Митрофана с Рязанскими митрополитами о границах соседних епархий был решен в конце концов в его пользу царем Петром Алексеевичем весною 1699 года. К Воронежской епархии теперь были присоединены Усмань, Демшинск, Белоколодезь и село Мокрый Боярак от Рязанской епархии, а от Белогородской — Острогожск, или Рыбный. Ранее того (в 1697 году) патриарх Адриан значительно расширил пределы Воронежской епархии, присоединив к ней новопоселенцев Воронежского уезда по рекам Битюгу, Икорцу и Осереду. При святителе значительно возросли отчины и угодья Воронежского архиерейского дома: одни из них были приписаны к нему духовной или светской властью по челобитным святого Митрофана, в которых он указывал на бедность своего архиерейского дома; другие были пожалованы государем Петром Великим, отличавшим святителя среди прочих иерархов.
Одной из первых забот святого Митрофана было построение нового кафедрального собора, ибо существовавшая тогда соборная церковь в честь Благовещения Пресвятой Богородицы была очень ветха. Еще в Москве, до переезда в Воронеж, святитель просил об отводе удобного места для постройки собора.