Первыми для допроса вызвали самых важных горожан: брата царицы Михаила Федоровича Нагого, ее родственников, городового приказчика Русина Ракова, представителей местного духовенства. Саму Марию Нагую члены комиссии не имели права допрашивать. Из всех допрошенных только Михаил Нагой заявил, что царевич Дмитрий был убит людьми дьяка Михаила Битяговского и за это угличане расправились и с самим дьяком, и его помощниками, и родственниками. Вызванный для очной ставки Русин Раков не подтвердил эту версию и своими показаниями заставил усомниться в ее правдивости. Он заявил, что в момент смерти царевича Михаила не было во дворе дворца, где разыгралась трагедия. Царицын брат прибежал позднее со своего подворья, где пьянствовал с друзьями. Услышав крики сестры, он умышленно стал натравливать угличан на дьяка Битяговского, с которым имел неоднократные стычки по поводу сбора налогов в царскую казну и выполнения государственных повинностей жителями Углича. (Нагие хотели безнадзорно властвовать в уезде, но дьяк им это не позволял.)
После этого для обличения неправды Михаила были вызваны другие свидетели: его родственники и очевидцы гибели Дмитрия, в числе которых были мамка В. Волохова, кормилица И. Тучкова, постельница М. Колобова и мальчики-жильцы, с которыми играл царевич. Все они говорили одно и то же: Дмитрий вместе с мальчиками играл в «ножички». Игра состояла в том, что необходимо было в броске ткнуть нож в очерченный на земле круг. Внезапно, когда в руке царевича находился острый нож, с ним случился приступ «падучей болезни», т. е. эпилепсии. Руки его начали судорожно двигаться, в одной был крепко зажат острый нож; во время падения Дмитрия на землю нож случайно вонзился в горло и, видимо, повредил сонную артерию. Когда начался припадок, все присутствующие будто оцепенели, и только когда Дмитрий упал, Ирина Тучкова бросилась к нему и подхватила на руки. Он еще был жив, но вскоре умер. Тут только все закричали от ужаса. На крики прибежала царица Мария. Увидев бездыханного сына, она без всякого разбирательства набросилась на Василису Волохову и стала избивать ее поленом. Потом она сорвала с ее головы платок (опростоволосить замужнюю женщину означало нанести ей страшное оскорбление) и стала кричать уже собравшимся угличанам, что царевича убили люди дьяка Битяговского: его сын Данила, племянник Никита Качалов и Осип Волохов, сын Василисы. В это время, на свою беду, во двор вошел дьяк Михаил Битяговский, чтобы узнать причину переполоха. Разгоряченные словами царицы угличане набросились на него и убили. Потом они ринулись на подворье Битяговских и в дьяческую избу, где обнаружили Данилу Битяговского и Никиту Качалова. Их тут же убили. Позднее нашли и Осипа Волохова. Он также стал жертвой ярости разбушевавшейся толпы.
Допрошены были и другие Нагие. Григорий не подтвердил версии Михаила о том, что царевич Дмитрий был убит людьми государева дьяка. Андрей сообщил об особенностях болезни царевича, о частых приступах, во время которых мальчик пытался покусать всех, кто был рядом с ним. Это объясняло то, что во время приступа во дворе никто не решился сразу прийти ему на помощь. Представители духовенства что-либо пояснить не могли, поскольку не были очевидцами происшедшего. В целом за несколько дней было допрошено больше 150 человек. Наиболее ценные показания были записаны и заверены. Многие из них дошли до наших дней в составе Угличского следственного дела. В ходе допросов В. И. Шуйский понял, что Мария и Михаил Нагие умышленно дезинформировали угличан, чтобы расправиться с ненавистным им государевым дьяком и его родственниками. Поняв, что со смертью царевича они навсегда лишаются возможности оказаться у царского трона, всю свою злобу и отчаяние они выместили на ни в чем не повинных людях. Поэтому после завершения следствия члены комиссии вызвали царицу и ее родственников к церкви и с помощью свидетелей обличили их неправду.