Развитие почитания мучеников побудило Церковь в IV–V вв., после прекращения гонений, определенным образом регламентировать это почитание. Отдельные его формы, совпадавшие с языческими, стали восприниматься как пережитки язычества и подверглись осуждению (так, блаженный Августин Иппонийский возражает против устройства поминальных пиршеств на могилах). Блаженный Иероним Стридонский говорит, что подобные эксцессы объясняются «простотой мирян и, конечно же, благочестивых женщин». В этом контексте происходит пересмотр актов мученичества и канонизация мучеников. Празднование памяти перерастает из частного обряда, совершаемого над могилой, в общецерковное торжество – сначала на уровне местной церковной общины, а затем и всей Церкви. Дни памяти различных мучеников (dies natalis) объединяются в годовой цикл, фиксируемый в мартирологах. На этой основе формируется неподвижный годовой круг церковного богослужения.
Представление о мучениках как заступниках за людей перед Богом, как о постоянно присутствующих членах церковной общины выразилось и в чине литургии. Мученики с древнейших времен особо упоминаются в ходатайственной молитве, произносимой во время совершения Евхаристического канона, и для них отделяется особая частица на проскомидии (при приготовлении Святых Даров). В честь мучеников вынимается пятая частица из третьей, так называемой «девятичинной» просфоры, разделяемой по чинам святых. Согласно русскому служебнику эта частица вынимается «в честь и память святаго апостола, первомученика и архидиакона Стефана, святых великих мучеников: Димитрия, Георгия, Феодора Тирона, Феодора Стратилата и всех святых мученик, и мучениц: Феклы, Варвары, Кириакии, Евфимии и Параскевы, Екатерины и всех святых мучениц».
В истории Русской Церкви первые мученики появились еще до Крещения Руси князем Владимиром: по сообщению Повести временных лет, в 983 году киевские язычники убили двух варягов-христиан (отца и сына). В 1015 году были убиты святые князья Борис и Глеб; понимание их гибели как мученичества свидетельствует о расширении в русской духовности самого этого понятия: хотя святые Борис и Глеб были убиты не за веру, а в результате междоусобия, их смирение в смерти и следование Христу и чтимым мученикам в непротивлении мучителям воспринимались как христианский подвиг. К числу русских мучеников относится и ряд святых, пострадавших за веру в Орде (князь Михаил Всеволодович Черниговский и боярин его Феодор, князь Михаил Ярославич Тверской), литовские мученики, пострадавшие от язычников при Ольгерде в 1347 г. и др. В настоящее время продолжается процесс канонизации мучеников Русской Церкви, пострадавших после 1917 г.
Наряду с мучениками в Церкви эпохи гонений почитались также исповедники, т. е. те верующие, которые исповедали Христа, претерпели за веру пытки, истязания или ссылку и заключение, но умерли естественной смертью. По словам святителя Иоанна Златоуста, «мучеником делает не только смерть, но душевное расположение; не за конец дела, но и за намерение часто сплетаются венцы мученичества».
Однако здесь было различие: пострадавшие за Христа до смерти члены Церкви вносились в списки святых без какого-либо исследования их жизни, а уже в силу их подвига – очищения мученической кровью, исповедники же, согласно свидетельству святого Киприана Карфагенского, разделялись на два класса: умиравшие вскоре после перенесённых ими страданий были приравниваемы к мученикам; жившие более или менее долго после них могли быть причтены к лику святых, если и последующую свою жизнь они проводили вполне праведную.
Церковь почитала страдальца мучеником только тогда, когда имелось полное убеждение, что человек не оступился во время мученического подвига, а совершил его в единстве с Церковью, всецело предавшись в руки всеспасительного Промысла Божия. Не могли, естественно, быть причислены к святым пострадавшие еретики или схизматики, а также отпавшие из-за церковного раскола или из-за предательства, или по нецерковным мотивам.
Епископ Аполлинарий Иерапольский свидетельствует о позиции Церкви применительно к мученичеству монтанистов: «Если члены Церкви, призванные к мученичеству за истинную веру, встречаются с так называемыми «мучениками», последователями фригийской ереси (т. е. монтанизма), они держатся особо и умирают, не входя с ними в общение».
9-е и 34-е правила Лаодикийского собора (ок. 360 г. или ранее), несомненно отражающие уже сложившееся церковное воззрение, прямо называют скончавшихся не за кафолическую веру лжемучениками и возбраняют (под угрозой отлучения) членам Церкви посещать места их захоронений с какой бы то ни было целью.
Правило 9: На кладбища всяких еретиков, или в так именуемыя у них мученическия места, да не будет позволено церковным ходити для молитвы или для врачевания. А ходящим, аще суть верные, быти лишенными общения церковнаго на некое время. Кающихся же и исповедающих, яко согрешили, приимати во общение.