Возникла очередная сложность в лице секретаря Марии — итальянца Давида Риччо, человека изысканных и вкрадчивых манер. Он был блестящим музыкантом и пленил ее любовными песнями; вскоре он стал ее ближайшим советником и поверенным. Вероятно, именно ему принадлежала инициатива отдаления королевы от Дарнли. Он обидел многих шотландских вельмож, возможно, самим фактом того, что был иностранцем, имевшим куда большее влияние на королеву, чем они. Поскольку Риччо был католиком, он вызывал недовольство и у протестантской знати. Шотландские изгнанники времен Марии во главе с графом Мореем лелеяли планы мести.
Они решили заручиться поддержкой Дарнли: он хотя бы был шотландцем. Они информировали его о том, что Риччо был единственной причиной падения его влияния и что секретарь «нанес ему величайшее оскорбление из возможных». Дарнли вступил с ними в союз, в котором ему обещали поддержку его притязаний на престол в обмен на содействие в убийстве Риччо. Морей и его последователи должны были быть помилованы за свой прошлогодний мятеж. После убийства Мария должна была быть заключена в замок Стерлинг; королева уже шесть месяцев носила под сердцем ребенка, однако вельможи, скорее всего, убедили Дарнли в том, что отцом ребенка был Риччо.
Вечером в субботу 9 марта 1566 года Мария принимала Риччо и некоторых других друзей в королевском дворце Холируд в небольшой комнате, примыкающей к ее покоям. Сразу после того, как они собрались, заговорщики под предводительством Дарнли пробрались по потайной лестнице и предстали перед ошарашенной королевой и ее гостями. Когда они оттолкнули Марию и схватили Риччо, он вскричал: «Правосудие! Правосудие! Спасите меня, миледи!» Он попытался схватиться за юбки королевы, но заговорщики оттащили его и поволокли в примыкающую комнату, где он получил пятьдесят шесть ударов кинжалом. Затем его тело стащили с лестницы и бросили у ее подножия.
Когда Мария спросила своего мужа, что побудило его совершить это преступление, он повторил клевету о том, что Риччо «удостаивался ее тела куда больше, чем он». Следующие несколько часов она оставалась в своих личных покоях, однако вскоре ей удалось убедить Дарнли в том, что следующей жертвой заговорщиков будет он. Она весьма точно угадала их злостные намерения. Они с самого начала планировали сложить вину за убийство Риччо на одного Дарнли и донести королеве, что ее муж решил совершить убийство у нее на глазах с целью покалечить ее и, возможно, нерожденного ребенка.
Дарнли был всерьез встревожен, и в полночь 11 марта он и Мария покинули дворец через помещение прислуги, оседлали коней и сбежали в Данбар. Прочие вельможи с исчезновением Дарнли разъехались; многие из них укрылись в убежище в Берике, что на территории Англии. Мария с триумфом вернулась в Эдинбург; там она замышляла месть по отношению к своему беспомощному и изменчивому супругу. Но отмщение необходимо было отложить до рождения ребенка. Этот ребенок служил предметом сплетен; поговаривали, будто его настоящим отцом был Риччо. Некоторые отталкивающие черты Якова VI Шотландского, который позже стал Яковом I Английским, оказались достаточными для долговечности этих слухов.
Елизавета была ошарашена бесчинством убийства, произошедшего в присутствии правящей королевы. «Будь я на месте королевы Марии, — сказала она испанскому послу, — я бы схватила кинжал своего мужа и нанесла ему удар». Поскольку в то время она вела переговоры о браке с эрцгерцогом Карлом с молчаливого согласия испанцев, то поспешила добавить, что не предприняла бы подобных действий в
Ранним летом 1566 года Мария Стюарт родила сына. Посланник с этой вестью прибыл в Гринвичский дворец в ходе пышного приема; он поднялся к Сесилу и прошептал новость ему на ухо. Сесил, в свою очередь, донес ее до своей госпожи. Говорят, что она пала в кресло и обратилась к присутствующим: «Королева шотландцев родила прекрасного сына, а я так и осталась бесплодной». Прием подошел к концу. По крайней мере, так описал это Мелвилл в своих мемуарах. По наблюдению Томаса Фуллера, «когда оживают воспоминания человеческие, истории следует поспешить на боковую». Но даже если сказанное королевой несколько приукрашено, оно остается очень уместным в описываемой ситуации.
Лишь двумя месяцами ранее Елизавета стала жертвой необычной болезни и исхудала настолько, что «можно было пересчитать все ее кости». Поговаривали, что она, может быть, больна чахоткой. «Ее величество, — писал Сесил английскому послу во Франции, — ощущает внезапную боль в животе и внезапно освобождает желудок. Вы можете подумать, что такое положение полностью выбивает человека из колеи, однако Господь есть оплот всех, кто в Него верует». Несмотря на то что королева держалась уверенно и даже властно, первые годы ее правления были омрачены постоянным ощущением незащищенности и опасности.