Через день после взрыва Мария присутствовала на свадебном пиру одной из ее камеристок; ей следовало объявить придворный траур сразу после трагедии, однако она тянула с решением пять дней. Ее мужа похоронили без каких-либо торжественных церемоний в часовне дворца Холируд. Было вполне очевидно, что его внезапное устранение из жизни стало для королевы огромным облегчением. Мария и Босуэлл стали появляться вместе на публике. Королева подарила ему лошадей и изысканные одежды своего мужа — поступок, который еще больше охладил к ней общественное мнение. Ходили слухи, что, несмотря на свое женатое положение, Босуэлл настойчиво добивался руки королевы.
Отец Дарнли граф Леннокс выдвинул против Босуэлла обвинения, которые полагалось заслушать в ходе открытого судебного процесса. Суд должен был состояться 12 апреля в городском магистрате, однако председатели оказались сторонниками Босуэлла; в то же время дворцовую охрану усилили на триста кавалеристов. Сам Босуэлл отправился к залу суда в сопровождении четырех тысяч дружинников. Граф Леннокс, почувствовав недоброе, побоялся появиться в Эдинбурге. Как и следовало ожидать, после более чем восьмичасового совещания Босуэллу вынесли оправдательный вердикт.
Несмотря на это, события теперь развивались столь стремительно, что никто не чувствовал себя в безопасности. Через девять дней после судебного процесса Мария отправилась в замок Стерлинг, чтобы забрать своего младенца-сына, однако попечитель мальчика граф Мар отказался отдать его матери. Он пришел в ужас от мысли, что юный наследник попадет в руки Босуэлла, убийцы его отца. Через три дня, 24 апреля, королева ехала из своего родного дворца Линлитгоу в Холируд, когда Босуэлл похитил ее и отвез в Данбар. Именно там ее и «обесчестили». Вместе с тем Мария прожила в замке двенадцать дней, не предприняв сколько-нибудь серьезных попыток спастись бегством или оказать ему сопротивление. 26 апреля Босуэлл отправился в Эдинбург, чтобы ускорить развод с первой женой. На следующий день королева официально ходатайствовала об аннулировании этого брака перед архиепископом собора Святого Андрея.
Некоторые вельможи королевства к этому времени испытывали столь сильное негодование и тревогу, что решили составить заговор против Босуэлла, которого называли «бесчеловечным тираном» и «жестоким убийцей». Вернувшись с торжественной процессией в Эдинбург, Мария и Босуэлл были встречены молчаливыми и угрюмыми толпами жителей. Несмотря на это, королева пожаловала своему возлюбленному титулы графа Оркни и лорда Шетланда. Участники сговора собирались теперь в замке Стерлинг, где организовали собственный королевский двор вокруг младенца Якова.
14 мая 1567 года Мария Стюарт и Джеймс Босуэлл сочетались браком в церемониальном зале дворца Холируд. Услышав новости о свадьбе, Елизавета выразила протест кузине. «Как же, — спросила она, — можно было сделать столь опрометчивый выбор для вашей чести?» К воротам Холируда кто-то из жителей прибил плакат с сатирическим двустишием:
Уильям Сесил писал, что в Шотландии наступил «сущий хаос; кажется, всех охватило волнение; самые добропорядочные хотят покинуть страну; самые бесчестные дрожат от угрызений совести».
Результатом этих обескураживающих событий стала гражданская война. Шотландские графы выступили против Босуэлла под знаменем, которое изображало мертвого Дарнли, лежащего под деревом, и младенца-принца, склонившего колени позади него. В середине июня Мария с новым мужем отправилась в замок Данбар, чтобы укрыться там в безопасности, но затем вывела войска на Карберри-Хилл в окрестностях Эдинбурга. Переговоры, предпринятые сторонами, не дали никаких определенных результатов, однако стало очевидно, что солдаты Марии не хотят сражаться со своими соотечественниками в гражданской войне. Чуть позже они перешли на сторону армии заговорщиков или попросту разошлись восвояси. Потянув время, чтобы дать возможность Босуэллу вернуться обратно в замок, Мария сдалась войску своих вельмож.
Для битвы Мария облачилась в мужские одежды, однако после поражения королеву, переодетую во взятое взаймы платье, спустили к подножию склона верхом на коне. Мария была явно беременна, что указывало всем собравшимся на ее внебрачную связь с Босуэллом до похищения и замужества. Когда она проезжала мимо солдат, некоторые из них выкрикивали: «Сжечь распутницу!» Ночью королеву попытались тайно вывезти из Эдинбурга, однако толпа уже поджидала ее с гневными оскорблениями. «Сжечь ее, сжечь ее, она недостойна жить, убить ее, утопить ее!» Никогда прежде Мария не сталкивалась с открытой яростью своих подданных. Ее увезли за 30 километров на север, а затем на лодке переправили в тюрьму на острове посреди озера Лох-Ливен, где она провела в заточении большую часть года.