Медицинская карьера Холстеда, в которой позже он достигнет неоспоримых успехов, во время его жизни в Йеле была лишь на уровне эскизного проекта, о чем сам он написал годы спустя: «В колледже все свои силы я посвящал исключительно атлетике. В последний год обучения я приобрел учебник анатомии Грея и книгу по физиологии Дальтона. Они показались мне весьма интересными. Тогда же я посетил несколько клиник Йельской медицинской школы». Вероятно, он имел в виду амбулатории штата Нью-Хейвен, учреждения, в которых работали преподаватели медицинской школы. Там выпускники набирались опыта, поскольку руководство больницы Нью-Хейвена не предоставляло преподавателям и учащимся института полномасштабного доступа к подопечным стационара. Клиника открылась в 1871 году. Вскоре одного здания стало недостаточно, и появились другие, более просторные корпуса, один из которых во время учебы Холстеда располагался на Краун-стрит, всего в нескольких кварталах от студенческого городка. Невольно задаешься вопросом, посещал бы равнодушный к наукам молодой спортсмен клинику, если бы она находилась на другом конце города, а не совсем рядом с его апартаментами? Поскольку, невзирая на то, что дядя Холстеда был врачом, нет никаких свидетельств его заинтересованности медициной в юные годы. Таким образом, география города, возможно, определила выбор его жизненного пути. Однако более вероятно, что именно его увлеченность книгой Дальтона сыграла решающую роль.
Независимо от того, что стало основополагающим стимулом, осенью 1874 года Уильям Холстед поступил в нью-йоркский медицинский колледж, где его влиятельный отец был членом попечительского совета. Хотя официально это учреждение считалось медицинским филиалом Колумбийского университета, на самом деле оно функционировало абсолютно независимо. Фактически оно принадлежало преподавателям факультета, как и все восемь медицинских школ Нью-Йорка в то время.
Согласно правилам колледжа, каждому учащемуся, которых в 1874 году насчитывалось пятьсот пятьдесят человек, назначался персональный наставник из штата педагогов. Ментором Холстеда был профессор анатомии Генри Б. Сэндс, который в 1879 году станет преподавателем практической хирургии. Холстеду повезло не только с выбранным мэтром. Он был настолько удачлив, что стал учеником ассистента автора его любимой книги по физиологии Джона К. Дальтона. Холстед не только прошел трехлетний курс обучения, но, по-видимому, испытал удивительную метаморфозу: он получил степень магистра с отличием. Он входил в десятку лучших студентов своей группы, особо отличившись на устных экзаменах, где представил работу под названием «Противопоказания к хирургическому вмешательству». Высокие оценки давали ему право принять участие в конкурсном письменном экзамене, победителю которого полагалась награда в сумме ста долларов. Холстед выиграл этот приз. К стажировке в те дни можно было приступить до официального присуждения докторской степени. Интернатура Холстеда началась в октябре 1876 года в больнице Бельвью и продлилась восемнадцать месяцев. Впоследствии он служил лечащим врачом в нью-йоркской больнице с июля по октябрь 1878 года.
Трансформация, начавшаяся в последний год его обучения в Йельском университете, теперь была завершена. Щеголь и спортсмен, который когда-то, беззаботно прогуливаясь, преодолевал несколько кварталов до амбулатории Нью-Хейвена, начал серьезно изучать медицину. Следующий шаг, особенно с учетом наличия финансовых возможностей, был неизбежен. По окончании службы в нью-йоркской больнице Холстед на два года отправился на пароходе в Европу для дальнейшего обучения. 4 ноября 1878 года молодой врач прибыл в Вену, где овладевал знаниями до следующей весны. Бо́льшую часть двухлетнего пребывания на континенте он работал в крупнейших немецкоязычных клиниках и ведущих мировых медицинских центрах.