Основание монастыря было положено строительством храма в 1592–1593 гг. во имя Донской иконы Божией Матери, возведенного на месте нахождения иконы в стане русских войск. Он построен предположительно архитектором Федором Конем, в типичном стиле годуновской эпохи. Росписи храма осуществлял итальянец А. Клаудио, резной иконостас — русские мастера. Сохранились сведения, что в иконостасе находилось портретное изображение Годунова, свидетельствующее, что ктитором храма являлся не царь Федор Иоаннович, а Борис Годунов. Во времена Федора Алексеевича монастырь становится одним из мест богомолья царской фамилии, и при нем начинается (1676–1679 гг.) большое строительство. К самому храму пристраивается трапезная, колокольня и два придела, а росписи поновляются русскими изографами Леонтием Чулковым и Федором Евтиевым. Устанавливается и новый иконостас. Строительство велось почти 10 лет, и, по преданию, оно продолжилось благодаря пожеланиям царевны Екатерины Алексеевны, сестры Петра I, и ее тетки Ирины Михайловны. В 1684 г. началось возведение нового собора, окончательная отделка которого продолжалась также много лет. Это было во многом связано и с тем, что новый царь Петр I запретил возведение церковных зданий за счет государственных средств, поэтому все работы осуществлялись за счет жертвователей. Пятиглавый собор был поставлен на высокий подклет и окружен двухъярусной галереей. Возведенный из красного кирпича в стиле нарышкинского барокко, он сразу стал хорошо заметной доминантой в окружающем пространстве. Семиярусный иконостас был изготовлен в посольском приказе и расписан итальянцем Антонио Клаудио. Под алтарем собора в 1711 г. на средства имеретинского царя-поэта Арчила Вахтанговича была устроена церковь Сретения Господня, где он будет позднее упокоен сам со своими сыновьями. К концу века подклет собора станет усыпальницей для многих других грузинских политических и культурных деятелей. А на средства царицы Дарьи Арчиловны в 1724 г. собор будет вымощен железными плитами. В 1686 г. приступили к возведению каменной ограды, которую закончили в 1692 г. на средства вдовы думного дьяка Я. Кириллова. В 1713 г. на средства царицы Прасковьи Федоровны и царевны Екатерины Иоанновны возвели церковь Тихвинской иконы Божией Матери над северными въездными воротами.
Тогда же возвели больничную церковь преподобного Ефимия на средства стольника И. Дурново. Строительство новых и обновление старых зданий монастыря продолжалось и в течение последующего времени. Была построена колокольня (1730–1750 гг.), архимандритский корпус (1749 г.), на пожертвования Донского войска заменены главки на Малом соборе. К концу XIX в. монастырский ансамбль получает окончательный свой вид, дошедший до наших дней без существенных изменений. Величественные храмы и нарядные стены монастыря олицетворяли государственную мощь и мудрую красоту православной обители, вознесенной в честь победы над крымскими татарами.
Первоначально обитель была небогатой. Царь Федор Иоаннович подарил монастырю лишь небольшие села Раменки и Семеновское, но скоро ему были отмежеваны все окрестные городские земли и приписан ряд монастырей. В 1739 г. он владел уже 880 крестьянскими дворами, 14 мельницами и множеством земельных и рыбных угодий. Особые земельные пожертвования монастырю сделала царевна Софья.
Обитель славилась неисчислимыми богатыми дарами многих царственных особ и известных аристократических фамилий. В иконостасе Большого собора стоял список с чудотворной иконы Богоматери, украшенный драгоценным окладом с каменьями. В алтаре было несколько рукописных Евангелий с серебряной отделкой, одно из них весом 4,5 кг, а также несколько панагий с бриллиантами, подарками от императриц Анны Иоанновны, Елизаветы Петровны, графа Г.Н. Румянцева и других. Хранились многие золотые сосуды, серебряные кресты с мощами святых, подаренные имеретинским царем Арчилом. Особую ценность представлял монастырский архив с дарственными грамотами и актами XVII–XVIII вв.
В 1745 г. по указу Синода монастырь стал ставропигиальным и занял в монастырской иерархии шестое место. Через два года в него была переведена Славяно-греко-латинская академия из Заиконоспасского монастыря, просуществовавшая здесь более 50 лет.