В то время как испанские и Тевтонский ордена претерпевали фундаментальные изменения, приведшие к прекращению ими активных действий, орден госпитальеров продолжал воевать. Его по-прежнему поддерживали и папа, и император, и многие другие правители. Папа Климент VII, выбранный в 1523 году при участии магистра госпитальеров, раньше и сам был членом этого ордена. После вынужденного отплытия с Родоса в 1523 году великий магистр родосских рыцарей Филипп Вилльс де л'Иль-Адан со своими рыцарями странствовал целых восемь лет по различным городам и весям в поисках новой постоянной резиденции, они побывали и в Мессине, и в Чивитавеккье, и в Витербо, и в Пицце, сохраняя во всех своих мытарствах организационную структуру ордена и его дух. Большинство членов ордена были французами, но помог им в конце концов испанский король, император Священной Римской империи Карл V. Он отдал ордену в ленное владение маленький скалистый остров Мальту с двумя соседними островами — Гоцо и Комино (в Средиземном море между Сицилией и северо-африканским побережьем), после чего госпитальеры стали называть себя мальтийскими рыцарями. Они признали сюзеренитет Сицилии и обязались защищать новый материковый плацдарм в Африке — Триполи, захваченный испанцами в 1510 году. Рыцари, однако, не теряли надежду вернуться на Родос или в Южную Грецию и поселились в 1530 году на Мальте без особого энтузиазма. Там к ним присоединились их латинские и греческие подданные, покинувшие Родос вслед за орденом. В это время Франция заигрывала с турками, так что госпитальеры оказались на Мальте исключительно по испанской инициативе, и даже магистром их в 1536–1553 годах был арагонец — Хуан де Омедес.
Мальтийский орден (как стал с этих пор называться орден госпитальеров) продолжал проводить активную антитурецкую деятельность, практически он стал форпостом христианских держав в борьбе с Османской империей, достигшей к этому времени апогея своего могущества. Вскоре после переселения на остров рыцари помогли императорскому флоту овладеть африканской крепостью Галетой. В 1531 году они участвовали в экспедиции в Южную Грецию, а в 1535 — в Тунис. В 1541 году мальтийские рыцари поддержали императорские войска, уже отступавшие под натиском алжирцев. Мальта располагала великолепной гаванью и, находясь между испанской Сицилией и османской Африкой, представляла собой прекрасную базу для ведения военных действий на море против турецких армад и африканских корсаров. Рыцари договорились о беспошлинном ввозе зерна из Сицилии и укрепили гавань. Они привезли с собой с Родоса свои реликвии и часть архива ордена и продемонстрировали замечательную способность приспосабливаться к новым условиям без ущерба для фундаментальной структуры орденского государства (из чего следует, что существование военно-монашеского ордена не обязательно зависит от его территориального местонахождения). В 1551 году Триполи был захвачен турками, а мальтийский остров Гоцо подвергся разрушительному нападению. Но рыцари продолжали воевать. Наивысшего расцвета Мальтийский орден достиг в правление великого магистра Жана де ла Валлетта (1557–1568), ветерана последней осады Родоса в 1522 году при котором Мальте пришлось выдержать страшную осаду турок. К моменту нападения османов крепость Сент-Анжело, новый город Изола и форт Сент-Эльмо при входе в гавань были уже хорошо укреплены. Турок бы то намного больше, чем защитников острова, но благодаря тому, что Жан де ла Валлетт был опытным и отважным воином и талантливым военачальником и ему помогало все мальтийское население. Мальта продержалась до прибытия спасательной экспедиции под командованием вице-короля Палермо и командора ордена Сантьяго Гарспара де Толедо. После четырехмесячной осады турки были вынуждены отступить, потеряв свыше двадцати тысяч человек.