Шесть лет спустя, когда турки потерпели поражение при Лепанто пять галер и 100 рыцарей были присланы новым военно-монашеским орденом, посвященным святому Стефану. Этот орден был основан в 1562 году Козимо I де Медичи, герцогом Тосканы, ставшим его первым великим магистром (эта должность в ордене была наследственной) Козимо превратил небольшую тосканскую флотилию в регулярную сильную эскадру по образцу мальтийской. Он хотел защитить свое побережье и морское судоходство и к тому же сплотить вокруг себя своих подданных-нефлорентийцев, новую привилегированную прослойку из членов созданного им ордена. В некоторых городах, находившихся в оппозиции Флоренции, таких как Сиена и Лукка, знать осталась верна Мальте, но в других местах ордену святого Стефана удалось переманить у госпитальеров целые семьи, хотя новый орден и не пользовался таким престижем. Рыцари могли вступать в орден святого Стефана и закреплять за собой статус знатного дворянина, взяв новое командорство под семейное покровительство; они могли вступать в брак как и члены ордена Сантьяго; они должны были нести военную службу в течение как минимум трех лет. Сыновья женатых командоров могли получить в наследство командорство, находившееся под семейным покровительством, а изъяны в происхождении их матерей можно было исправить дополнительными денежными взносами; более того чем чаще командоры отказывались от своих должностей, тем быстрее могли завоевать себе знатный статус члены тех же семей. Все это, вместе взятое сильно отличалось от мальтийских представлений об образе жизни монашествующих рыцарей и о знатности происхождении, но нельзя не признать, что орден святого Стефана активно участвовал в священной войне на море.
Штаб-квартира ордена святого Стефана находилась в Пизе и имела собственную морскую академию, а его монастырская церковь была построена по эскизам Джорджо Вазари. Вскоре орден уже насчитывал сотни членов, как тосканцев, так и уроженцев других частей Италии; в 1563–1737 годах им было построено не менее 695 командорств Флот ордена базировался в Ливорно и оттуда вел операции по защите побережья и перевозок, а также принимал участие в дальних экспедициях, часто вместе с кораблями госпитальеров. В 1565 году орден послал две галеры на помощь Мальте. Тосканские галеры совершали рейды на африканские берега, в Эгейском море и в районе Кипра. Они были организованы в единую эскадру и добычу делили поровну, но, в отличие от кораблей госпитальеров, галеры ордена святого Стефана не совершали самостоятельных, получастных пиратских набегов (