Если в этом направлении политика русского правительства оказалась безрезультатной, то в иных отношениях именно в последней трети XVI в. им были приняты меры, последствия которых имели существенное влияние на развитие взаимоотношений восточноевропейских государств с Османской империей. Драматические события 1569–1572 гг. послужили толчком не только для основательной реорганизации сторожевой службы, но и для создания вдоль южного берега Оки своеобразного оборонительного рубежа — Засечной черты длиной 500 км, — опиравшегося на систему укреплений и лесных завалов; создается и сеть крепостей на месте сторожевых пунктов к югу от Оки. Система обороны была разрушена в годы Смуты, но к середине 30-х годов XVII в. Засечная черта была восстановлена и правительство приступило к созданию расположенной значительно южнее от Оки Белгородской черты (800 км), по мощности укреплений превосходившей старую линию. Насыщенная значительными войсками, Белгородская черта (ее строительство завершилось в 1653 г.), как надежный барьер, преградила путь татарским войскам. Набеги татар в середине 40-х годов XVII в., когда, прорвав оборону, они взяли полон в ряде русских пограничных уездов, стали последними. После этого они нападали почти исключительно на лишенные такой линии обороны украинские земли. В полном объеме последствия происшедших перемен сказались уже во второй половине XVII в.
Русское правительство сумело добиться успеха не только потому, что систематически бросало на его достижение огромные материальные и людские ресурсы: он был в значительной мере обусловлен тем, что созданию «засечных черт» предшествовала, а затем и сопутствовала крестьянская колонизация земель русского черноземья. Именно из этой среды и происходили значительные контингенты постоянных защитников рубежей русской обороны.
Процесс колонизации запустевших от нашествия Золотой Орды, а затем от набегов крымцев земель юга развивался не только в России, но с большой интенсивностью и на юге Украины, хотя здесь население не всегда могло рассчитывать на сколько-нибудь надежную охрану. Главным стимулом, заставлявшим русских, украинских, а отчасти и белорусских крестьян уходить на пограничье и жить в условиях постоянной угрозы со стороны кочевников, было стремление избавиться от усиливавшегося крепостнического гнета. Немалая часть беглых здесь вливалась в ряды вольного казачества. Примерно с середины XVI в. возникали казацкие поселения на Дону и в Запорожье, на самой границе османских владений в Восточной Европе. Уже с этого времени казаки постоянно вели «малую войну» с крымскими улусами и гарнизонами турецких крепостей в Причерноморье, ставшую для казачества одним из постоянных источников существования.
Во второй половине XVI в. казаки наносили серьезный ущерб Орде, существенно ограничивая возможности ее набегов. Размах их действий постепенно увеличивался, выходя за рамки локальных конфликтов. В 70-е годы XVI в. отряды запорожских казаков неоднократно приходили на помощь выступавшим против османов жителям Молдавского княжества, даже выдвигали из своей среды претендентов на молдавский господарский трон. Казачество становилось самостоятельной силой, способной оказывать серьезное влияние на развитие международных отношений в Причерноморье. Традиция совместной борьбы казачества и балканских народов получила свое продолжение во время так называемой Долгой войны между Османской империей и Габсбургами на рубеже XVI–XVII вв.
Хотя к началу 70-х годов XVI в. держава османов, казалось, находилась на вершине могущества, в действительности она уже вступила в полосу затяжного внутреннего социального кризиса. Падала боеспособность османского войска. На Балканах социальные противоречия переплетались с национальными. Стремясь во время постоянных войн пополнить пустующую казну, правительство султана ликвидировало податные привилегии ряда прослоек местного «военно-служилого» населения, оказавшегося с продвижением османской границы на северо-запад не на пограничье, а в тылу. В результате здесь появилась сила, способная организовать борьбу масс, недовольных османским господством. Выход из трудностей великий везир Синан-паша, правивший делами при неспособном султане Мураде III, искал на традиционном пути — в подготовке новой войны, на этот раз с Габсбургами.
Однако уже в первые годы развязанной османским правительством войны (1593–1606 гг.) выяснилась ошибочность этих расчетов. От Османской империи отпали и перешли на сторону Габсбургов Дунайские княжества и Трансильвания. Армия императора Рудольфа II добилась определенных успехов, войска валашского господаря Михая Храброго нанесли серьезное поражение османам, перенеся военные действия на земли к югу от Дуная. Валашскому войску активно помогали отряды болгарских и сербских гайдуков, а после первых побед над османами начались волнения и в тылу османской армии, на болгарских землях. Приняли участие в войне и большие отряды украинского казачества во главе с будущим вождем народного восстания Северином Наливайко.