В 1522 году из-за произвола киевских воевод печерская братия во главе с архимандритом Игнатием вынуждена была подать жалобу королю о том, что воеводы киевские часто, по нескольку десятков раз в год, приезжают в монастырь и вымогают у братии и настоятеля подарки и что монастырским людям делается великая кривда, когда их заставляют давать подводы и кормы королевским и крымским послам и гонцам. Поначалу король удовлетворил просьбу братии и освободил их от поборов. Но вскоре он сам вмешался в дела Печерской обители, отстранив от настоятельства архимандрита Игнатия и поставив настоятелем своего человека.
Год спустя покровитель Киево-Печерской обители, князь Константин Иванович Острожский, и монастырская братия подали жалобу на нового настоятеля, прося вернуть настоятельство архимандриту Игнатию. Благодаря заступничеству Острожского король выполнил их просьбу.
В 1550 году скончался и был погребен в Великой Печерской церкви князь Константин Острожский.
В 1544 году печерская братия вынуждена вновь подать жалобу королю на притеснения воеводы, князя Андрея Соколинского.
В 1579 году в Успенском соборе был установлен памятник князю К. И. Острожскому. В том же году король Стефан Баторий выдал Печерскому монастырю грамоту подтверждающую его права и привилегии.
В 1594 году посол Эрих Лясота посетил Киево-Печерскую Лавру и составил ее подробное описание.
С 1596 года, когда по воле короля Сигизмунда III митрополит Киевский Михаил (Рагоза) принял так называемую Брестскую унию, согласившись признать главенство папы Римского, Киево-Печерская Лавра становится главным оплотом Православия на территории Речи Посполитой (Польши). Сразу же после принятия митрополитом унии печерская братия во главе с архимандритом Никифором отказала архипастырю-отступнику в повиновении.
В 1597 году возный земли Киевской Роман Овсяный, исполняя приказ короля, прибыл с двумя другими лицами в Лавру, дабы передать ее униатам. Но перед воротами обители встретили его иноки, поддержанные вооруженными казаками, и объявили ему: «Мы имеем архимандрита, иного нам не нужно; митрополита в Киеве нет, а Михаила Рагозу, которого за отступничество от Православия наши духовные низложили, мы не признаем за митрополита и увязать его в наш монастырь не дозволим». Возный пытался отворить монастырские ворота, однако монахи не пустили его в обитель.
В следующем, 1598 году человек короля Ян Кошиц вместе с киевским возным Лаврентием Толочко и двумя шляхтичами, прибыв к Лавре, нашел монастырские ворота запертыми и у ворот несколько сот вооруженных казаков, гайдуков и слуг монастырских. Тотчас вышли и монахи и на предложение Кошица впустить его в Лавру для передачи ее Рагозе отвечали: «Знаем, зачем ты приехал и какие имеешь листы от короля; тех листов и слышать, и видеть не хотим и монастырь наш крепко охранять будем. Король ничего не имеет до нас, и мы не должны его слушать, так как он нарушает наши права и вольности». Кошиц старался склонить монахов к уступчивости, но они остались непреклонными.
По кончине архимандрита Никифора (Тура) в 1599 году, король Сигизмунд и униатский владыка Ипатий (Потей) несколько раз пытались прибрать к рукам Киево-Печерскую Лавру, но братия, поддержанная воеводой киевским, князем Константином Константиновичем Острожским, смогла отстоять свое право свободного выбора настоятеля.
В 1605 году, наконец, был избран преемник архимандрита Никифора – архимандрит Елисей (Плетенецкий). Это был очень деятельный настоятель; он не только защищал Лавру и другие обители и их владения от нападения униатов, но и в 1614 году основал в Киево-Печерской Лавре типографию.
В 1616 году типография Киево-Печерской Лавры выпустила свою первую книгу «Часослов».
В 1619 году в типографии Лавры вышла вторая книга «Анфологион» – избранная Минея на весь год.
В 1620 году православные, собравшиеся со всех областей Речи Посполитой в Киево-Печерскую Лавру на праздник Успения Божией Матери просили Иерусалимского Патриарха Феофана, бывшего проездом на Украине, восстановить православную иерархию, разрушенную унией. В результате митрополитом Киевским был поставлен Иов (Борецкий).
Польский король Сигизмунд III, рьяно поддерживавший унию, так и не признал восстановленную православную иерархию. Под покровительством короля продолжились и нападения униатов на Киево-Печерскую Лавру.
В 1624 году скончался печерский архимандрит Елисей, его преемником стал архимандрит Захария (Копыстенский).
В 1627 году архимандритом Киево-Печерской Лавры становится Петр (Могила). Будучи весьма образованным человеком, он создает в 1651 году в Лавре высшее училище и объединяет его со школой киевского братства.
В 1652 году, по инициативе нового короля Владислава, печерский архимандрит Петр избран митрополитом Киевским. Новому митрополиту пришлось столкнуться со многими проблемами, в разрешении которых деятельную помощь ему оказывала печерская братия.