В начале XVI века тюркоязычные, исповедовавшие ислам ногайцы переселились в низовья Волги, на земли Большой Орды, уничтоженной крымскими татарами; четкой политической организации у них не имелось. Будучи отличными коневодами, они пригоняли летом в русские земли – порой даже в Москву – большие табуны лошадей для продажи. После взятия Казани ногайцы, зажатые между Московским государством и Крымом, присягнули в верности Москве (1557), но отношения с ней так и не стали прочными. Когда в 1630-х годах калмыки перебрались на левый берег Волги, большинство ногайцев поселились восточнее Азовского моря, оказавшись под покровительством крымских татар. Позднее, когда Россия стала продвигаться в сторону северокавказских степей, ногайцы стали для нее серьезным препятствием.
С 1630-х годов России приходилось считаться и с калмыками, оказавшимися в низовьях Волги, в прикаспийских степях. Это были монгольские племена, которые в результате междоусобиц оказались вытеснены в степи Центральной Азии. Ламаисты по религиозной принадлежности, они стали основывать монастыри, и занятая ими территория превратилась в оплот буддизма. В 1655 году они заключили союз с московским царем и участвовали в военных кампаниях на стороне России, получая взамен продовольствие, оружие и так далее. Но они не прекращали набегов, служивших основой их экономики, и на русско-калмыкской границе было неспокойно в течение всего этого столетия.
Защиту от калмыков обеспечивали яицкие и донские казаки. В отличие от небольших ватаг в Сибири, казачьи общины на крупнейших реках у западной оконечности Шелкового пути (Днепр, Дон, Яик) часто бывали многочисленными и могущественными – в этом случае рядом с ними охотно селились крестьяне. Присутствие казаков на территории от нижнего Яика до южной Башкирии фиксируется как минимум с 1591 года, когда некоторые из них приняли участие в военных действиях на стороне русских. Яицкие казаки были типичным многоэтничным и многоконфессиональным сообществом, включавшим немало мусульман и даже отдельных калмыков-буддистов. Судя по реестру начала XVIII века, там встречались выходцы из донских, запорожских, северокавказских казачьих общин, крымских, ногайских и астраханских татар; попадались также башкиры, чуваши, мордвины, калмыки, шведы и поляки. В конце XVII столетия появились старообрядцы, и казачье войско стало отождествляться с этими носителями консервативных убеждений. Для России яицкие казаки являлись типичными посредниками – жителями срединных земель: охраняя границу с калмыками, они пользовались значительной политической и военной автономией. Помимо совершения набегов, они вели лов рыбы на Яике и получали от России хлеб, оружие и прочие выдачи.
Донские казаки в XVII веке защищали Россию от крымских татар и, в меньшей степени, от калмыков. Присутствие их в низовьях Дона отмечается с конца XV века; к XVII веку они уже образовывали многочисленную и могущественную группу, политически гораздо более сплоченную, чем яицкие казаки. Обитая на территориях между Российской и Османской империями, они сооружали крепости для защиты от набегов ногайцев, крымских татар и калмыков; жизнь самих казаков тоже проходила главным образом в набегах. Но они также поставляли Москве информацию в обмен на оружие и припасы, выполняя важные разведывательные функции по мере продвижения России на юг. К середине XVI века донские казаки установили с Россией прочные отношения, получая ежегодные зерновые выдачи – довольно крупные – и обладая привилегией вести торговлю в русских городах в обмен на участие в походах (казаки были в составе русских войск, бравших Казань и Астрахань) и совершение разведывательных миссий.
Земли, на которых проживали донские казаки, в XVI–XVII веках пользовались самоуправлением и делились на станицы, управляемые казацкими старшинами согласно казачьему праву. Казачьи атаманы умело вели переговоры с Москвой: донские казаки не платили России прямых налогов, сохраняли свою полковую организацию и свои политические институты, не допускали введения у себя крепостного права, пользовались личными свободами – такими, как право носить яркую одежду по образцу турецкой. Казаки были русскоязычными и в XVII веке формально исповедовали православие, к которому, однако, примешивались языческие практики; первая православная церковь в Черкасске, донской столице, появилась лишь при Петре I. Многие переходили в старообрядчество.