Москва слабо контролировала этот беспокойный приграничный регион, предоставив тамошним обитателям широкую автономию. Казачьи полки сохраняли независимость, Россия выставляла их против крымских татар, посылая в походы или используя для обороны линии. В крепостях и острогах распоряжались воеводы, но в целом административная и политическая система этой области была скопирована с казачьего полкового самоуправления, действовавшего повсеместно в русских землях. Вся территория делилась на пять полков, которыми, в соответствии с казачьими обычаями, управляла казацкая старшина. Казаки пользовались такой автономией, какой не было ни у кого в центральных русских регионах: право на винокурение, право на использование наемного труда, свобода торговли, право на владение землей, право избирать лиц, занимающих официальные должности. В 1670-е годы была сооружена Изюмская черта (южнее Белгородской), призванная защитить Слободскую Украину и стать опорой для продвижения России к Черному морю. Она образовывала своего рода петлю, следуя вдоль Северского Донца в его нижнем течении и Оскола, проходя через Усерд и Валуйки; в вершине петли располагались Царев-Борисов и Изюм.
Первые сведения о башкирах, живших в лесостепи восточнее Волги, относятся к X веку. Традиционный ареал их проживания был ограничен крупными реками – Волгой на западе, Тоболом на востоке, Камой на северо-западе, Яиком (позднее – Урал) на юге. То были тюркоязычные кочевники, принявшие ислам еще до вхождения в состав Золотой Орды (которая, в свою очередь, стала мусульманской в XIV веке) и жившие согласно шариату и обычному праву. В северной, лесистой части зоны своего обитания они вели полукочевой образ жизни, занимаясь охотой, ловлей зверей, рыболовством, разведением пчел, а иногда и земледелием. Но большинство башкир были кочевниками-скотоводами, проживавшими южнее, в лесостепи; они разводили лошадей, овец и коз. После распада монгольской державы башкиры платили дань Казанскому ханству (на северо-западе), ногайцам (на юго-востоке) и Сибирскому ханству (на востоке).
После завоевания русскими Казани в 1552 году некоторые башкиры – на севере и западе – присягнули России (1557), но рассматривали это, согласно степным традициям, как отношения между равными и допускали возможность восстания, если партнер станет ущемлять их интересы. Вскоре начались конфликты. Русские землевладельцы и крестьяне, продвигаясь на восток, постепенно заселяли наиболее плодородные башкирские земли, а представители средневолжских «ясачных» народов – татар, мордвы, чувашей, черемисов – и беглые крестьяне восточнославянского происхождения стремились уйти из-под контроля Москвы. В 1574 году была основана крепость Уфа, в 1586 году ставшая городом. Тем самым русские власти способствовали дальнейшей колонизации этих земель, куда в принудительном порядке переселялись также ссыльные и служилые люди. Кроме того, государство начало селить там крепостных, которые работали на новооткрытых уральских рудниках и металлургических заводах. Башкиры периодически поднимали мятежи, недовольные появлением «строгановских» городков и острогов (1570–1580-е годы) и укреплением Уфы (1587). Наконец, вместе с другими народностями Средней Волги они участвовали в массовых антирусских восстаниях в Смутное время (1605–1613). Россия отвечала на это решительно и жестоко, усиливая свой контроль над Башкирией на всем протяжении XVII века.
Однако у башкир имелись основания и для сотрудничества с Россией: им доставляли беспокойство проживавшие в степи ногайцы, а затем вытеснившие ногайцев калмыки. Чтобы защититься от этих нападений, Россия в 1650-х годах соорудила Закамскую черту, которая шла параллельно Каме на юге от нее – от Белого Яра на Волге (южнее Симбирска) до Мензелинска на Урале. Для защиты линии привлекались местные башкиры (так называемые «верные башкиры») – благодаря этому башкирский народ упустил возможность объединиться, а Россия получила нужную ей военную помощь.