Воевода Евстафий-Остап Дашкович предложил сейму создать передовую охранную линию в низовьях Днепра. Сейм одобрил этот проект и постановил организовать в низовьях Днепра четырехтысячное войско, на вооружение и содержание которого собрать особый налог. Войско, охранявшее Подолию, возглавил Евстафий Дашкович. Он отобрал четыре тысячи казаков, разделил их на полки и сотни, назначил старшин, полковников, есаулов, сотников и десятников, устроил казацкий суд и старших казаков. Ежегодно он менял две тысяч казаков, находившихся «на Низу», на других, отпуская первых «в поле», в степь. С самого начала украинское казачество делилось на два вида — служащих на границе и живущих дома до того времени, пока их не позовут в военный поход.
Первый поход состоялся в 1516 году — тысяча двести казаков во главе с Дашковичем дошли до Ак-Кермана в турецких владениях, разбили татарскую орду и вернулись, пригнав с собой пятьсот лошадей и три тысячи гопов скота. В 1515 и 1521 годах казаки по приказу властей ходили в поход на московские окраины. В 1522 и 1523 годах в походах на Крым казакам помогали полки князя Константина Острожского.
Днепровская стража поначалу была малочисленна и не могла бороться с большими войсковыми соединениями врага. Сформировать большое казацкое войско было поручено Богдану Ружинскому, командующему войсками на украинских землях. Он организовал несколько местных казацких полков. Они получили свои названия по городам и местечкам, где находились — «Киевского полка, Киевская сотня». Все казаки были переписаны; составлен именной список, названный реестром; сами казаки стали называться реестровыми. Половина казаков составили конницу, вооруженную за собственный счет ружьями, пистолями, саблями и копьями, предназначенную для действия «в поле». Вторая половина, пехота, вооруженная ружьями, копьями и кинжалами, предназначалась для обороны городов и местечек. Во время военных действий реестровые казаки получали жалованье, иногда одежду. В мирное время они занимались хозяйством, ремеслом, торговлей, были свободны от налогов.
Во второй половине XVI века казачество за днепровскими порогами создало свой военный центр — Запорожскую Сечь. Запорожская земля стала центром казачьей силы. Великий Тарас Шевченко писал:
«I пiду я одружуся
З моiм вiрним другом —
На Хортицi у матерi
Буду добре жити,
У оксамитi ходити,
Меда — вина питии!»
Первая казацкая крепость, ставшая прообразом Запорожской Сечи, была построена в 1550-х годах на днепровском острове Малая Хортица князем Дмитрием Вишневецким, позднее прозванным или отождествлявшимся народом с украинским народным героем казаком Байдой. Потомок Рюриковичей и Гедиминовичей, староста черкасский и канеский Дмитрий Вишневецкий собрал и объединил казацкие отряды, совершил несколько походов в Крым и в 1553 — 1556 годах построил первый форт на Малой Хортице — «город напротив Конских Вод», колыбель украинского казачества.
Казаки назвали Дмитрия Вишневецкого своим гетманом. До этого предводители казачьих отрядов назывались атаманами. Это слово, вероятно тюрского происхождения, означало выборного предводителя. Позднее у запорожцев главой войска стал кошевой атаман. Само слово «гетман» (польское «hetman», чешское «hejtman», немецкое «hauptman») означало «начальник, предводитель». В Чехии в период гуситских войн именно гетман руководил таборитскими войсками. В Польше и Литве первоначально гетманами назывались командующие наемными войсками. Позднее, с XVI века, пожизненное звание гетмана носили командующий всеми вооруженными силами государства — великий гетман, коронный гетман, его заместитель польный гетман. С первого казацкого командующего Д. Вишневецкого гетманами стали называть выборных глав реестровых и запорожских казаков.
Первые запорожцы взяли турецкую крепость Ислам-Кермен и пушки оттуда встали на хортицких камнях, охраняя запорожский кош. Крымский хан дважды осаждал Хортицкую крепость, но взять ее не смог. Запорожцы ушли сами, когда кончились еда и боеприпасы.
С этого времени казаки стали постоянно жить на днепровских островах, «чиня большие шкоды кочевьям перекопского хана». Уже тогда запорожцы не очень считались с верховной властью Польской Короны. Они быстро становились грозной силой. Казачество дралось с крымскими татарами, наказывая их за набеги. Казаки выходили в море и атаковали турецкие суда. У запорожцев стали складываться обычаи и традиции.
После объединения Польши и Великого княжества Литовского в 1569 году в Речь Посполитую, созданные в украинских городах казачьи полки поступили под начало особого «казачьего старшого», непосредственно подчиненного коронному гетману. Запорожские казаки не подчинились королю Сигизмунду и, несмотря на его запреты, продолжали драться с турками и татарами. Несколько тысяч казаков не смогли в 1574 году остановить объединенные турецко-татарские войска. Враги сожгли окраинные города и местечки, набрали громадный полон и вернулись в Крым. Запорожцев не поддержали ни Польша, ни Литва — захватчики до собственно польских и литовских земель пока еще не доходили.