Церковь предназначалась для духовного окормления рабочих и мастеров, работавших на адмиралтейских верфях. Поскольку царь был на верфях частым гостем, то и он нередко заходил в этот храм. А в феврале 1712 г. он даже совершил в Исаакиевской церкви обряд венчания с Екатериной Алексеевной. К этому времени они были уже пять лет как практически тайно, без огласки обвенчаны, и демонстративно совершенный обряд должен пресечь ходившие в народе слухи о непотребном образе жизни царя. Перед венчанием здание оштукатурили, а шпиль колокольни обили железом.
Освятили церковь в день рождения Петра I, который приходился на день памяти византийского монаха преподобного Исаакия Далматского. Поэтому церковь посвящена именно этому святому, жившему во второй половине VI в. Он прославлен церковью за свою непримиримую борьбу с арианством, осужденном в 325 г. на I Вселенском соборе в Никее как еретическое учение. Суть арианства заключалась в том, что его последователи не считали Иисуса Христа Богом и отрицали Троицу. Сторонником арианства являлся и византийский император Валент, который распорядился арестовать Исаакия и бросить его в темницу. Там преподобный пробыл до смерти Валента и был освобожден взошедшим на престол императором Феодосием.
В 1717 г. деревянное здание первой церкви сгорело, после чего приняли решение строить новую, каменную церковь. Место для нее выбрали на берегу Невы, примерно там, где ныне стоит памятник Петру I — «Медный всадник». В августе 1717 г. Петр I лично заложил камень в основание церкви. Проект здания подготовил архитектор Г.-И. Маттарнови, который и руководил строительством вплоть до своей смерти в 1721 г. Затем строительство вел архитектор Н. Ф. Гербель, который также его не закончил, поскольку в 1724 г. умер. Заканчивал строительство архитектор Я. Неупокоев (по другим данным — архитектор Г. Киавери). Строительством колокольни и отделочными работами руководил архитектор М. Земцов.
В 1727 г. работы были закончены. Внешне новая церковь, с одной стороны, чем-то походила на Петропавловский собор, а с другой — на римскую базилику. Многоярусную колокольню венчал высокий шпиль. На колокольне установили привезенные из Амстердама куранты. Прекрасный резной позолоченный иконостас выполнил резчик И. П. Зарудный.
В 1722 г. в церкви начали проводить службы, а в 1723 г., незадолго до своей смерти, Петр I издал указ о том, что моряки Балтийского флота должны принимать присягу именно в Исаакиевской церкви. Но главный придел освятили только в 1727 г., уже после смерти императора, в присутствии Екатерины I, а левый придел протопоп Петропавловского собора освятил и вовсе в сентябре 1735 г.
В тот же год, но в апреле, в церковь ударила молния. Она вызвала сильный пожар, уничтоживший внутреннее убранство храма.
Уже к концу строительства выяснилось, что место для новой церкви выбрано неудачно. Рыхлый, пропитанный водой протекающей рядом реки грунт не выдерживал тяжести большого каменного здания. Он начал проседать, и в стенах появились трещины. Для того чтобы стены не рухнули, в 1739–1742 гг. церковь пришлось дополнительно обнести каменной галереей. Работы по восстановлению храма после пожара и возведению каменной галереи выполнялись под руководством архитектора П. А. Трезини.
Однако осадка грунта продолжалась, и проведение в церкви служб стало попросту опасным. С августа 1759 г. алтарь из Исаакиевской церкви перенесли в бывшую домовую церковь графа А. П. Бестужева-Рюмина, посвященную Благовещенью Пресвятой Богородицы. Его дом стоял на месте нынешнего здания Сената, построенного К. И. Росси. Там службы проводились до строительства новой, третьей по счету Исаакиевской церкви. Старую же церковь в 1761 г. велели разобрать, но выполнили это распоряжение только в 1763 г.
Екатерина II приняла решение о строительстве третьей Исаакиевской церкви в 1762 г. Годом ранее проект нового храма был подготовлен архитектором С. И. Чевакинским, который предложил и новое место для строительства. На этом месте стоит нынешний Исаакиевский собор. Но Екатерина, согласившись с местом, предпочла проект архитектора А. Ринальди, которому и поручили возведение новой церкви во имя Исаакия Далматского.
Согласно проекту Ринальди, храм должен был иметь центральный купол на высоком барабане, четыре башни-беседки по углам и отдельно стоящую высокую колокольню. Для внешней и внутренней отделки предусматривалось использовать разные сорта сибирских мраморов, олонецкий мрамор и мрамор из Италии.