В 1619 г. Давидово-Вознесенскую пустынь разорили литовские войска и «черкасы», так тогда называли жителей Малороссии. В это время русским царем был первый представитель династии Романовых – Михаил Федорович. В 1619 г. отец царя митрополит Филарет, остававшийся заложником у поляков, возвратился в Москву и вскоре был возведен в сан Патриарха Московского и всея Руси. Патриарх Филарет полностью руководил поступками и решениями сына-царя, он был фактическим правителем государства. Патриарх Филарет хорошо понимал значимость монастырей в возрождении и укреплении Московского государства, особенно после опустошительного Смутного времени. При царе Михаиле Федоровиче этот монастырь был восстановлен.
Следующие московские цари и патриархи своим вниманием Давидово-Вознесенскую пустынь не жаловали, монастырь постепенно стал сдавать свои позиции. В 1657–1667 гг. он был приписан к Воскресенскому Новоиерусалимскому монастырю, в 1712–1721 гг. – Московскому Златоустовскому. Но в 1727 г. этот монастырь, поправивший свои хозяйственные и финансовые дела, стал самостоятельным. Затем у монастыря снова появились сложности. В 1764 г. в процессе кампании секуляризации монастырских земель Давидово-Вознесенскую пустынь лишили почти всех ее и так немногочисленных угодий, оставив на собственном содержании; обитель стала заштатной. В то время основные доходы монастырю давали сборы от двух принадлежавших ему часовень. В Москве Давидово-Вознесенской пустыни принадлежала часовня у Москворецкого моста, в которой пребывала древняя, очень почитаемая святыня – чудотворная икона Всемилостивого Спаса. Кроме того, монастырю принадлежала другая часовня – у Калужской заставы.
Чтобы поддерживать религиозную значимость Давидово-Вознесенской пустыни, в этом монастыре в 1760–1778 гг. находилось Хатунское духовное правление.
В конце ХVIII в. этот монастырь оказался в поле особого внимания митрополита Московского Платона, по инициативе которого в Давидово-Вознесенской пустыни ввели общежительный устав. Митрополит Платон, понимавший исключительную значимость монастырей в жизни и развитии России, оказывал большую помощь Давидово-Вознесенской пустыни.
Поскольку на протяжении всей своей истории Давидово-Вознесенская пустынь никогда не обладала большими земельными угодьями и другими материальными богатствами, то благополучие и жизнеспособность обители полностью зависели от сообразительности и хозяйственной предприимчивости ее настоятелей. Среди них своим хозяйственным талантом ярко выделялся игумен Паисий (Соколов), который был разносторонне способным человеком. Он находил новые и упрочивал имевшиеся направления хозяйственной деятельности монастыря, которым он управлял в 1843–1854 гг. Он смог обеспечить финансирование и осуществить большое строительство в монастыре в 1845–1851 гг., кроме того, он добился значительного расширения его территории.
Опыт предприимчивого игумена Паисия учли его преемники. В 1888 г. при монастыре открыли кирпичный завод, что облегчило ведение строительно-ремонтных работ в обители. Продажа части произведенного кирпича давала денежные поступления в монастырскую казну. В ХIХ в. в монастыре сделали пасеку с особой системой ульев, которая получила медали на пчеловодческих выставках в 1867 и 1868 гг.
Среди настоятелей монастыря особое место занимает архимандрит Валентин, оказавшийся последним управителем обители перед ее закрытием. Он управлял этим монастырем 44 года. При этом о. Валентин еще с царского периода был известен своей широкой благотворительностью и просветительской деятельностью. Отец Валентин не обладал ярким предпринимательским талантом, но в период очередной смуты и трудностей жизни при новой власти на первое место по значимости для его прихожан вышли его доброта, образованность, способность к сопереживанию и сочувствию. Он пострадал вскоре после закрытия Давидово-Вознесенской пустыни: его убили неизвестные.
Навечно оказались физически связанными с Давидово-Вознесенской пустынью две яркие исторические личности, которые были похоронены в этом монастыре, – преподобный Давид Серпуховской и генерал Д.С. Дохтуров.
В 1529 г. умер основатель монастыря Давид, он был похоронен в созданной им обители. Мощи преподобного Давида были главной святыней пустыни. Здесь хранился гроб, в котором ранее почивало тело Моисея Угрина. Гроб этот передал обители митрополит Платон, который привез его из Киева, где мощи этого святого уже находились в другой раке. Две эти главные святыни монастыря приводили в него много паломников, в том числе очень известных и уважаемых. Давидово-Вознесенскую пустынь посещали церковные иерархи, в том числе трое русских святых: митрополиты Московские Филарет, Иннокентий, Владимир (Богоявленский), а также митрополит Платон и др., что способствовало упрочению авторитета и привлекательности обители для паломников.
Монастырь был местом захоронения представителей знатных дворянских фамилий: Оболенских, Романовских, Васильчиковых, Головиных и других.