Для подготовки к предстоящей экспедиции Николай Михайлович усиленно взялся за поиски литературы по данному вопросу. Он буквально дневал и ночевал в библиотеке Сибирского ИРГО, жадно впитывая все знания, что только были в ней по Уссурийскому краю. Не оставлял он без внимания и периодическую литературу: журналы, газеты, составляя свой конспект по данной теме, выписывая любую полезную для него в будущем информацию, а также готовил нового помощника.
Обучение Ягунова и подготовка литературы несколько задержало отъезд, несмотря на желание будущего путешественника как можно скорее приступить к делу. Новая обстановка произвела на него сильное впечатление и Сибирь его поразила. Достигнув своего заветного желания, Пржевальский стал чаще посещать библиотеку. Неутомимость его была поистине феноменальна.
Годы, проведённые в Варшаве среди польских учёных Е. Александровича и В. Тачановского, принесли ему огромную пользу.
К первой экспедиции Н. М. Пржевальский готовился основательно. Для дальнейшего изучения естественных наук, он просил своего друга И. Л. Фатеева выслать ему из Варшавы вновь вышедшие листы зоологического атласа А. Фрича и поручил узнать, нет ли хорошего полного французского или немецкого атласа млекопитающих, гадов и рыб; просил выслать ему польско-русский лексикон (толковый словарь, устар.), следующие выпуски птиц Брема и прочие.
Начали путешественники свой путь 26 мая 1867 года, преодолев расстояние от Иркутска почти 1300 км. 5 июня они прибыли в начальную точку своего путешествия село Сретенское, на р. Шилке. В то время по всей Амурской речной системе ходило 24 парохода по определённому графику. Путешественники ждали всего 4 дня, и 9 июня их пароход отошёл от пристани. Однако спустя некоторое время он налетел на подводный камень и получил пробоину. Благо рядом оказался Шилкинский завод, где судно поставили на ремонт.
А путешественники дальше отправились на лодке, чему очень обрадовался Н. М. Пржевальский, так как смог, причаливая к берегу, подробней изучать местную флору и фауну, также проводить съёмки рельефа местности. С 14 июня путешественники прошли по воде около 280 км до устья Шилки, где та встречалась с Аргунью и обе впадали в Амур. Преодолев дополнительно около 800 км, они проинспектировали наличие на левом берегу р. Амур от устья Шилки до Благовещенска поселений конного казачьего полка.
20 июня прибыли в Благовещенск, насчитывающий в то время 3500 душ. Тут жили в основном чиновники и военные. Но к счастью, их нагнал пароход, на котором они отправились дальше по Амуру из Албазина до Николаевска, преодолев расстояние 1500 тысяч км. Однако дела заставили их задержаться в с. Хабаровке, которая по тому времени имела населения чуть более 2000 жителей, где Пржевальский купил лодку и нанял гребцов-казаков для дальнейших исследований на реке Уссури. Преодолев по ней около 400 км, он посетил ст. Буссе, где остановился в той же квартире, где по случайному совпадению в 1860 году когда-то жил ботаник Максимович.
Прибыв в район озера Ханка, он побывал в новых деревнях: Турий-Рог (или Воронежская), Троицкая и Астраханская, образованный переселенцами из Воронежской, Тамбовской и Астраханской губерний. Что касается туземного населения, то он насчитал там только 7 одиноко стоящих китайских фанз[118]. Три недели по заданию учёных ИРГО он изучал растительный и животный мир в окрестностях озера, успев собрать более 1200 растений, сделать 60 чучел птиц и нашёл 22 неизвестных вида, постоянно по дороге проводя метеонаблюдения.
Общий вывод, который он сделал из своих исследований, заключается в том, что