Известие о битве при Павии всколыхнуло Италию. Один из двух соперников оказался явно слабее другого: становилось ясно, что если не изменить ход событий, то итальянским государствам останется только склониться перед волей всемогущего победителя. Уже в мае 1526 г. во французском городе Коньяке был заключен союз между вернувшимся из плена и не собиравшимся выполнять навязанные ему обязательства Франциском I и рядом итальянских государств. Участниками Коньякской лиги (1526–1529) стали папа Климент VII, Венеция, Флоренция; ее протектором объявил себя король Англии. Даже не дожидаясь французов, итальянские участники лиги в том же, 1526 г. открыли военные действия против имперцев, стремясь изгнать их из Милана, но вели войну очень нерешительно. 6 мая 1527 г. разразилась катастрофа: имперские войска взяли Рим и подвергли город страшному разгрому, капитулировавший папа вышел из лиги. Лишь после этого в Италию вступила французская армия, которая, повторив маршрут Карла VIII, в апреле 1528 г. начала осаду Неаполя. Новой участницей лиги вместо папы стала Генуя, где в августе 1527 г. было свергнуто проимперское правительство: с моря Неаполь был блокирован союзным флотом Франции, Венеции и Генуи. Однако неожиданный выход Генуи из коалиции ослабил силы осаждавших, и в августе 1528 г. французская армия, потерпев тяжелое поражение, сняла осаду Неаполя.
Договоры, заключенные в 1529 г. Карлом V с Францией и итальянскими государствами, подвели итоги его войны с Коньякской лигой. Итальянцы должны были признать неоспоримую гегемонию императора: в декабре 1529 г. был оформлен многосторонний союз Карла V с папой, Венецией, Миланом, Савойей и другими итальянскими государствами. Изгнавшая Медичи Флорентийская республика пала после девятимесячной героической обороны в августе 1530 г., вернувшиеся Медичи стали отныне герцогами Флоренции и верными вассалами Габсбургов. Франциск I по Камбрейскому миру (август 1529 г.) отказался от притязаний на Италию и от феодального сюзеренитета над фактически принадлежавшими Карлу V Фландрией и Артуа; зато он был освобожден от исполнения пункта Мадридского договора об уступке Бургундии, дети его, остававшиеся заложниками, были возвращены из плена за выкуп.
Разгром Коньякской лиги означал крах последней попытки итальянских государств вести самостоятельную политику в борьбе между Францией и Империей. Существенные изменения произошли в политике двух торговых республик, Генуи и Венеции. Генуя бесповоротно входит в сферу габсбургского влияния. Венеция перестает участвовать в Итальянских войнах, перейдя к политике устойчивого нейтралитета. Перед Францией встала проблема поиска новых союзников для борьбы с Карлом V на Средиземном море, и в конце концов такой союзник был найден в лице турецкого султана.
Борьба за Италию не прекратилась, в действие вступили новые факторы, ослаблявшие империю Карла V. С 1530-х годов приобретает международное значение борьба в Германии между католиками и протестантами, сплотившимися в 1531 г. в Шмалькальденскую лигу. С 1540-х годов становится явным факт антигабсбургского военного союза Франции и Турции.
Франко-габсбургская война (1536–1538 гг.) началась в ответ на оккупацию Милана в октябре 1535 г. имперскими войсками после пресечения династии Сфорца; отныне город потерял даже формальную независимость, став владением Габсбургов, принявших титул Миланских герцогов. Франциск I счел себя вправе получить компенсацию, выступив с притязаниями на Савойю, так как его мать, Луиза Савойская, была старшей сводной сестрой правившего герцога. Французские войска заняли Савойю и большую часть Пьемонта с Турином, попытки Карла V выбить их оттуда оказались безуспешными, равно как и вторжение имперцев в Прованс и Пикардию. Согласно подписанному в Ницце в июне 1538 г. перемирию, Франция удержала за собой Савойю и две трети Пьемонта (одну треть, где признавалась власть савойского герцога, оккупировали имперцы). Таким образом, Франция приобрела в Италии важный плацдарм, вплотную прилегавший к французской границе, что создавало благоприятные возможности для постепенного органического слияния вновь присоединенных земель с основной территорией королевства.