К концу XVI века православие в Украине было неспособно конкурировать с обновленным протестантством и посттридентским католицизмом. На Тридентском соборе (1545–1563) католическая церковь, вслед за протестантами, приняла масштабный план конфессионализации. Были определены основные принципы вероучения, подтверждено сохранение обрядов, таинств, догмата о благодати, представлены новый катехизис, новое издание Библии, наставительные и другие религиозные труды, некоторые – на местных языках. Новая учебная программа – преподавание велось на латыни – включала современные дисциплины и языки, что отражало новое положение уверенной в себе церкви. Стали посылаться миссионеры в различные страны Восточной и Западной Европы. Православие же в Украине пребывало в спячке: духовенство получало недостаточное образование, современные учебные заведения отсутствовали, верующие в своей массе были неграмотными. По этой причине оно выглядело малопривлекательным для украинской и белорусской элиты – и в интеллектуальном, и в духовном отношении.
Украинские православные иерархи рассматривали унию с католичеством как возможность для обновления церкви. Речь шла не о доктринальных, а о чисто практических изменениях: усилить контроль высшего духовенства над приходами и приходскими священниками, улучшить пастырское образование, добиться для православных епископов такого же политического статуса, какой имели католические (прежде всего членства в Сенате), а для священства – освобождения от налогов и судебных привилегий, которым пользовались католические пресвитеры. Предполагалось признать высшую власть папы при сохранении основных особенностей православия (возможность вступать в брак для священников, обряды, таинства, богослужение на церковнославянском языке, причащение вином и хлебом). В отношении немногих догматических расхождений между церквями были применены положения Ферраро-Флорентийской унии, включая компромиссную интерпретацию филиокве (в католической церкви догмат о Троице был изменен с указанием, что Святой Дух исходит не только от Отца, но и от Сына (filioque), в документах унии был закреплен вариант «через Сына») и принятие учения о чистилище. Отдельные недавние новшества (Праздник Тела и Крови Христовых, некоторые новые святые) отвергались. Однако в конечном счете Святой Престол потребовал принять все постановления Тридентского собора в обмен на сохранение восточного обряда. Оказавшись в безвыходном положении, большинство украинских епископов признали Брестскую унию. На нее дал согласие король Сигизмунд III, объявив униатство единственной законной разновидностью православия в Речи Посполитой. Собственность православной церкви были конфискована, на священников оказывали давление, чтобы те приняли унию. Православие в его традиционном виде оказалось под запретом.
Уния вызвала у православных чрезвычайно резкую реакцию. Два епископа из западной Украины заявили, что не признают ее. Могущественный магнат князь Константин Острожский, православный по вероисповеданию, выражал несогласие с ней в польском сейме и в судах. Он нашел поддержку не у дворян (многие из которых обращались в католичество), а у горожан. Православные братства во Львове, Киеве и других городах стали открывать школы и типографии, чтобы защитить свою веру. Запорожские казаки оказали военную поддержку; православные иерархи, обучавшиеся в иезуитских коллегиях и умевшие бить противника его же оружием, приступили к возрождению своего православия, что в данном случае означало преимущественно конфессионализацию. Во главе их встал митрополит Петр Могила, основавший в 1632 году Киевскую (позднее Киево-Могилянскую) коллегию по образцу иезуитских школ. Петр Могила преобразовал церковное управление для усиления надзора за священниками и улучшения пастырского попечения, проводил в своей епархии визитации по примеру католиков, опубликовал на местном языке переработанный служебник (1629, 1639), Номоканон (1629) и требник (1646). Его катехизис – «Православное исповедание Кафолической и Апостольской Церкви Восточной» – был составлен в форме вопросов и ответов наподобие католических катехизисов и содержал много католических понятий (семь смертных грехов, главные добродетели, идея чистилища). Одобренный церковным собором в 1640 году и изданный в 1646 году, он вскоре стал основным для всех православных церквей, кроме русской. В 1684 году русский патриарх Иоаким одобрил его применение в русских церквях, и он оставался основным до появления катехизиса Прокоповича в 1740 году.