Мало известно о том, как были вооружены галеры госпитальеров. Можно предположить, что они несли стандартное для того времени вооружение. Например, венецианские галеры XIV века имели абордажную команду из 30–50 человек, вооруженных мечами, а также 10–20 человек арбалетчиков. Генуэзский морской устав 1330 года, по-видимому, во многом походивший на устав госпитальеров, предписывал, чтобы на галере экипажем в 176 человек, включая младших офицеров, было 12 арбалетчиков, в том числе четверо мастеров, вооруженных двумя арбалетами. Кроме того, галера комплектовалась 160 кирасами, 160 горжетами, 170 шлемами, 12 дополнительными арбалетами, 5000 арбалетными болтами, а также копьями, дротиками и алебардами. Капитан корабля и корабельный писец должны были иметь более тяжелые доспехи, тогда как боцман — более легкие. К 1483 году на галерах появились пушки. Так как центр атаки и обороны галеры находился на баке, почти вся команда корабля концентрировалась там.
Служба на кораблях была обязательной для госпитальеров. Экипажи галер были очень пестрые. Здесь были матросы, гребцы и солдаты из различных районов Европы и Азии: русские, итальянцы, греки, испанцы и многие другие. Тактика предусматривала высадку на берег и перехват торговых кораблей. Широко применялись небольшие галиоты с 12–22 скамьями для гребцов. Хорошее знание местных особенностей повышало эффективность флота госпитальеров. Обычно галеры действовали парами. Пока экипаж одной галеры выполнял задачи на берегу, вторая галера прикрывала первую с моря. При встрече с противником госпитальеры шли на абордаж, используя такое приспособление, как клюв, обычное для средиземноморских галер.
Береговые операции проводились крупными силами. В «Тиран-ло-Блан» дается живое описание флотилии галер, плотным строем приближающихся к берегу так, чтобы все корабли его достигли одновременно. У берега галеры разворачивались, так как высадка десанта проходила с кормы. Турецкий автор так описывал десант госпитальеров в Измире: «Тридцать галер подошли к Измиру. Бесчисленные франки были закованы в железо с ног до головы».
Бой между флотами в открытом море был редкостью. Но если случался, то боевые галеры выдвигались вперед, формируя линию, в то время как транспортные галеры и малые корабли оставались в резерве. Различия в размерах, числе и тактики христианских и мусульманских флотов также описаны в «Тиран-ло-Блан». Над палубой растягивались сетки, которые предохраняли палубу от метательных снарядов, а также затрудняли абордаж. Шкафут и бак обвешивались матами, которые смягчали удары ядер. Доспехи снимали с раненых и передавали их тем, кто сохранил боеспособность. После боя трупы и раненых противников сбрасывали за борт. Размеры галер легко представить по словам турецкого автора: «Их марсели, как крепости. На их кораблях солдат без счета». При этом, говоря об «их кораблях», турок употребляет слово «cog», очевидно имея в виду нечто другое, чем небольшой корабль, характерный для Северной Европы. Возможно, турок имел в виду транспортные карраки, которые госпитальеры использовали вместе с галерами для переброски десанта. Самый большой каррак госпитальеров был спущен на воду в Ницце в год, когда орден покинул Родос.
Судно госпитальеров «Санта-Анна» вышло в море в 1524 году, став самым мощным боевым кораблем на Средиземном море. Корабль имел четыре мачты, его водоизмещение составляло 3000 тонн. Впервые в Европе корабль получил обшитый металлом киль. Вооружение из 50 больших и многочисленных малых пушек располагалось на двух орудийных палубах. Корабль нес вооружение для 500 солдат и 100 рыцарей. Запасов провианта хватало для полугодичного пребывания в море. Корабль был оснащен пекарней и несколькими кухонными печами. На борту находился небольшой сад из кипарисов и мандаринов, предназначенный для отдыха магистра и его окружения.
Военный успех рыцарей-госпитальеров основывался на постоянном контролировании морских вод от Туниса до Калабрии, причем главной целью госпитальеров было не потопление вражеских кораблей, а захват добычи, выкупы и рабы.
Ко времени прибытия на Мальту боевая мощь орденского флота госпитальеров состояла из четырех кораблей: большой баракки (тип парусно-гребного судна, распространенный в Южной Италии) «Санта-Анна» и трех галер — «Сан-Джованни», «Аквила» и «Санта-Мария Витториозо». Остальные корабли, на которых прибыли рыцари и их имущество, были простыми транспортами и не годились для ведения боевых действий. «Санта-Анна» считалась одним из самых больших кораблей своего времени, но она была тихоходна и слабоманевренна. В 1548 году, когда содержать ее стало слишком дорого, она была взорвана. 23 октября 1553 года на Мальту обрушился невиданной силы ураган, в результате которого на дне моря оказались почти все галеры ордена вместе со своими экипажами.