Несмотря на разгром московских войск в 1514 году под Оршей, москвичи отбили у Княжества Смоленск, который еще несколько раз переходил из рук в руки. Войны сменялись перемириями, войска чужих и своих держав шли через постоянно разоряемые белорусские земли.
Иван IV, ставший первым московским царем, стал добиваться для Москвы гавани на Балтийском море. В 1558 году началась двадцатипятилетняя война. Ливонский орден был почти уничтожен. Его великий магистр обратился к королю польскому и великому князю Литовскому Сигизмунду II Августу с просьбой принять Ливонию в состав союзного государства. Часть Ливонии стала литовско-польской провинцией Инфлянты, а образованное из другой части Ливонии Курляндское герцогство признало себя вассалом Великого княжества Литовского.
Вмешательство Польской Короны и Княжества в Ливонскую войну привело к очередной войне с Московским царством. Военные действия переместились на белорусские земли. В 1563 году московская армия взяла Полоцк, стояла у стен Витебска, Орши, Шклова. С другой, южной стороны, литовско-белорусские земли постоянно атаковали крымские татары, почти ежегодно нападавшие на Княжество. Великое княжество Литовское оказалось на грани военно-политической катастрофы. Польша напомнила магнатам Княжества об унии, предложила войти в состав Польши. Магнаты соглашались только на династическую унию.
Общий сейм открылся в январе 1569 года в Люблине и продолжался почти полгода. Не договорившись, послы Великого княжества Литовского покинули Люблин. В ответ польские войска заняли половину литовско-белорусских земель. В Княжестве остались земли, на которых находилось московское войско, активно строившее свои крепости — Козьяны, Туровлю, Улу, Ситно, Красную. Магнаты Княжества попытались вести переговоры с Иваном IV, который в ответ только рассмеялся. За это время занятые поляками литовско-белорусские земли присягнули Польской Короне.
1 июля 1569 года Люблинская уния была подписана. Было создано полуфедеральное государство — Речь Посполитая, с одним выборным королем, он же и великий князь Литовский, с общим сеймом, единой внешней политикой. Общего правительства не было, но предусматривалась единая денежная система. К Польше отходили Волынь, Подляшье, Киевщина, Подолия. Великое княжество Литовское сохранило свое правительство, войско, казну, законодательство, суд. Полякам запрещалось занимать в Княжестве государственные должности, покупать недвижимость.
Новый глава Речи Посполитой избирался на общем сейме с титулом — король Польский, великий князь Литовский, Русский, Прусский, Мазовецкий, Жемайтский, Киевский, Волынский, Подляшский и Инфляндский. Великий князь Литовский отдельно больше не избирался. Права поляков, литовцев и белорусов уравнивались. Сохранялся титул Княжества, его печать. В общем Сейме Речи Посполитой из 180 депутатов сто мест было у поляков, 46 — у литовцев, 34 — у белорусов.
Избранный королем Речи Посполитой Стефан Баторий не стал ставить Великое княжество Литовское в жесткое подчинение Польской Короне. Это помогло ему свести на нет почти все достижения Московского царства в Ливонской войне, чему, впрочем, активно способствовала неумная политика Ивана IV.
Люблинская уния была дополнена религиозной Брестской унией 1596 года. Было оформлено новое направление в христианстве — униатство. С конца XIV века в Княжестве действовали три церкви — римско-католическая, греко-католическая и православная.
Магнаты Великого княжества Литовского называли себя «властителями государства». Богатство и политическая власть позволяли им чувствовать себя некоронованными властителями страны. В Совете господ активно действовали Сапеги, Друцкие, Воловичи, Вяжевичи, Зеновьевичи. В Передней Раде заседали Острожские, Ходкевичи, Елебовичи. Роль выдающихся политических деятелей XV–XVII веков в белорусской истории очевидна. Все важнейшие события этой эпохи происходили с их прямым участием и вошли в европейскую историю как великие дела, заслуживающие баллад и песен, саг и былин. По делам своим были равны монархам Константин Острожский (1460 — 1530), Астафий Волович (1520 — 1587), Николай Радзивилл (1515 — 1565), Ян Ходкевич (1560 — 1621), Лев Сапега (1557 — 1633), вошедший в белорусскую историю с титулом Великий.
Князья рода Острожских происходили из древних пинских и туровских князей. Константин Иванович Острожский, правнук знаменитого Ольгерда, стал великим гетманом литовским в 37 лет. Взятый в плен после поражения в битве у Ведроши, Константин Острожский в 1507 году бежал из Москвы, обманув догнавшую его погоню. Великий князь Литовский Сигизмунд вновь назначил его великим гетманом литовским. Князь Константин отбросил отряды крымских татар, доходивших до Вильны. Для этого он получил «права диктатора». При ведении боевых действий ему должны были подчиняться князья, воеводы, шляхтичи, которых за неповиновение он мог карать «горлом и тюрьмой». Но славу свою князь Константин получил не в боях с крымскими ордами.