В XVI веке оба государства опять вступили в состояние войны. Формальным поводом для нее был подготовленный Москвой «переход» нескольких удельных князей Великого княжества Литовского на сторону Московского государства вместе с территориями. Попытка решить конфликт дипломатическим путем успеха не принесла. 14 июля 1500 г. войска Константина Острожского (4 тыс.) были разбиты московским войском (40 тыс.) на р. Ведрош, недалеко от Дорогобужа. Острожский и часть его войска вместе со знатными князьями и боярами попали в плен. В результате битвы ВКЛ очутилось в тяжелом военно-политическом положении. В 1503 г. было провозглашено шестилетнее перемирие и определены новые границы между государствами. К Москве отошла четверть всей территории ВКЛ с 19 крупнейшими городами, в том числе Гомелем, Брянском, Черниговом, Новгород-Северским, Стародубом. Это была первая потеря белорусских этнических земель. Новые границы давали возможность Московскому Великому княжеству продолжать наступление на всю территорию ВКЛ. Александр планировал отвоевать потерянные территории, однако не успел. Это попытался сделать Жигимонт I. Однако в ответ на его ультиматум московский князь Василий III в 1507 г. начал военные действия (война 1507–1508 гг.). Пока посполитое рушение собиралось на войну, московские отряды прошли далеко в глубь княжества, но потом вынуждены были отступить. Второй этап войны был связан с мятежом 1508 г. Один из богатейших и влиятельных литовских магнатов Михаил Глинский хотел создать самостоятельное княжество с опорой на православный элемент ВКЛ. Василий III поддержал бунтаря, пообещав ему передать занятые им в ВКЛ крепости. Основная часть феодалов Беларуси и Украины его не поддержала, поэтому бунтовщики стали фактически вспомогательным войском Василия III. Жигимонт I послал на борьбу с мятежниками значительные силы во главе с гетманом К. Острожским. Подразделения Глинского отступили к Орше, а потом и совсем покинули границы белорусских земель. Свою жизнь Глинский закончил в московской тюрьме. Война 1507–1508 гг. никому не принесла успеха и окончилась «вечным миром», который закрепил границы по результатам предыдущих войн.
В 1512 г. началась новая война Москвы за Смоленск, который московская армия сумела взять только в 1514 г. Чтобы закрепить победу, Василий III направил свою 40-тысячную армию в глубь ВКЛ. Навстречу ему двинулось феодальное ополчение княжества – не более 35 тыс. человек во главе с К. Острожским. 8 сентября 1514 г. под Оршей состоялась жестокая битва, в которой московское войско было разбито. М. Карамзин в «Истории государства Российского» отмечал: «Литовцы никогда не получали такой славной победы над россиянами: гнали, резали, топили их в Днепре и Крапивне; телами усеяли поля между Оршей и Дубровной… ночь и леса спасли остатних». Потери московского войска составили около 16 тыс. человек. В плен попали все главные и верховные воеводы, 37 начальников меньшего ранга, более 2 тыс. других воинов, а также 2 тысячи детей боярских. Победителям достались 20 тыс. трофейных коней и половина войскового обоза. Причинами поражения московского войска являются слабое вооружение и отсутствие единоначалия, разрозненность действий воевод. Потери союзного войска К. Острожского были небольшими: погибли четыре знатных пана и около 500 рыцарей. После оршанского сражения Острожский повел свои войска на Смоленск, но овладеть городом не смог. Военные действия приняли затяжной характер. В последующие годы война велась на белорусской территории: русские войска грабили население, жгли города и деревни. Попытка подписать мир в 1517 г. провалилась, и только после длительных переговоров в Москве в 1522 г. было заключено перемирие на пять лет. Смоленск оставался за Москвой. Смерть Василия в 1533 г. пробудила в ВКЛ надежды на возвращение потерянных территорий, и в 1534 г. великий князь Жигимонт I Старый направил свое войско на Смоленск. В ответ Московская держава бросила на ВКЛ крупные силы и опустошила Полесье, Полотчину, Поднепровье. В 1537 г. было подписано очередное пятилетнее перемирие. Княжеству был возвращен только Гомель. В результате войн конца XV – первой половины XVI в. Москва отвоевала значительную часть восточных земель ВКЛ.