Интрига против гетмана подействовала тем успешнее, что он и без того сделался очень нелюбим своим народом (непопулярен). В этом отношении свидетельства малороссийских летописцев и вообще современных наблюдателей нисколько не противоречат официальным обвинениям его врагов. В начале своего гетманства Самойлович был приветлив, ласков и доступен. Но по мере того, как укреплялся в своем властном положении, он становился горд и заносчив, в особенности после падения своего соперника Дорошенка. Постоянное милостивое внимание московского правительства и частые от него подарки еще более его возгордили. Он стал держать себя надменно не только с простыми казаками, но и со старшиною, и даже с духовными лицами, хотя сам был из поповичей, ездил в карете, вообще образом жизни и высокомерным обращением походил на польских панов. Такими же панами держали себя и его сыновья. Но что в особенности вооружало население против гетмана и его сыновей – это их ненасытная алчность или любостяжательность. Полковничий или другие войсковые уряды получались только за посулы; многие угодья отбирались у владельцев на гетмана; а чтобы некому было приносить жалобы, он несколько лет не назначал генерального судью и тому подобное. Учреждение оранд, то есть аренд или откупов, на продажу горелки, дегтя и тютюна (табака) вызывало большое раздражение, хотя они были установлены с согласия московского правительства и предназначались собственно на жалованье наемных полков, пеших сердюцких и конных компанейских. По всем признакам, существовавшее против гетмана народное неудовольствие еще более раздувалось его противниками из среды казацкой старшины.
Главным двигателем интриги, без всякого сомнения, явился облагодетельствованный Самойловичем, самый доверенный и приближенный к нему из сей старшины – генеральный есаул Иван Степанович Мазепа; а сему последнему помогало доверенное у гетмана лицо, его канцелярист Василий Кочубей. В Москву часто ездили тот или другой с поручениями от гетмана, и вкрадчивый Мазепа пользовался сими поездками, чтобы расположить московские власти, а особенно князя Голицына, в свою пользу; кроме того, через окольничего Неплюева, несколько раз приезжавшего в Батурин по поручению из Москвы, они передавали интимные переговоры и планы, а также все те неосторожные речи, которые недовольный гетман иногда позволял себе в кругу старшины насчет московских правителей, да и передавали то, по всей вероятности, в преувеличенном смысле.
Таким образом, почва со всех сторон была подготовлена, и яма искусно вырыта недальновидному Самойловичу.
Во время обратного похода сочинен был обширный донос на гетмана и 7 июля подан князю В.В. Голицыну за подписью казацкой старшины. Во главе подписавшихся видим генерального обозного (ведавшего войсковую артиллерию) Василия Борковского. За ним следуют: судья Воехович, писарь Прокопович, есаул Иван Мазепа, полковники Константин Солонина, Яков Лизогуб, Григорий Гамалея, Дмитрашко Райча, Степан Забела. Внизу отдельно стоит подпись Василия Кочубея, еще не принадлежавшего к войсковой старшине, а только канцеляриста. Этот донос главным образом распространялся о неприязненных отношениях Самойловича к вечному миру с Польшей и к войне с Крымской ордой: по поводу вечного мира он даже не велел служить благодарственные молебны; а пристрастие его к басурманам будто бы доходило до того, что он радовался, когда слышал о победах турок над поляками и цесарцами, и не любил читать присылаемые ему с Москвы выписки из курантов о победах христиан над басурманами. Тут приводились его вышеуказанные и другие неосторожные выражения насчет московского правительства; повторялось нелепое обвинение в умышленном степном пожаре, в каких-то коварных советах, например, относительно того, что поход был предпринят не осенью, а ранней весной. Мосты, построенные на реке Самаре, гетман, переправясь с казаками, будто велел сжечь, и шедшая за ним московская рать принуждена была делать новые мосты. Поставлен был ему в вину даже такой случай. Однажды на обеде у обозного московский полковник Борисов заспорил с Гамалеем. Последний возразил: «Что ты, полковник, на меня кричишь? Ведь (вы) не саблею нас взяли!» Гетман при этих словах рассмеялся и ничего не сказал, следовательно, одобрил. Наконец, исчислены были и разные черты его властолюбия и корыстолюбия, возбудившие к нему общую нелюбовь, грозившую перейти в явный бунт. А в доказательство его замыслов сделать из Малороссии для себя удельное княжество приводилось то обстоятельство, что младшую свою дочь он не хотел выдать ни за украинского, ни за великороссийского человека, а вызвал для нее из польских областей князя Четвертинского (сын киевского митрополита). На основании всех сих обвинений доносчики от имени всего войска Запорожского били челом великим государям, чтобы Самойлович как изменник был лишен гетманства, со всей семьей взят в Москву и там казнен.