То же самое Хольцер повторил на второй пластинке с анти-В-сывороткой от раствора 1:1 до раствора 1:256. Теперь он приготовил две суспензии из свежих красных кровяных телец – одну с анти-А-тельцами, другую – с анти-В-тельцами. Затем в каждую ячейку с раствором анти-А-сыворотки добавил малое количество телец группы А, в каждую ячейку с раствором анти-В-сыворотки добавил то же количество телец группы В. В промежутке от 10 до 30 минут Хольцер наблюдал, в каких ячейках происходит агглютинация. Теперь он мог определить, до какой степени раствор анти-А-сыворотки и анти-В-сыворотки агглютинируют кровяные тельца, то есть в каких из восьми ячеек сыворотка сохраняет свою силу, а в каких теряет. Сильная сыворотка действовала еще и в растворе 1:256, ослабленная сыворотка действовала до раствора 1:128, 1:64 или 1:32. Но в каждом случае силу сыворотки (или ее титр, говоря научным языком) можно было определить и изучить. Обе сыворотки, чья сила была теперь ясна, Хольцер использовал для проверки кровавого пятна неизвестной группы. В две маленькие пробирки он поместил соскоб следов запекшейся крови или частички материала со следами крови, добавил туда сыворотку и 24 часа продержал пробирки в холодильнике. Затем пробирки были помещены в центрифугу, при этом излишние анти-А-сыворотка и анти-В-сыворотка снова отделились от составных частей крови запекшегося следа. Хольцер изъял излишек сыворотки из пробирок и с каждым из образцов сыворотки на двух следующих пластинках проделал то же самое, что с сывороткой в свежем нетронутом состоянии. Обе сыворотки были распределены по ячейкам в растворе разной степени от 1:1 до 1:256. Хольцер снова взял суспензии кровяных телец групп А и В, такие же, как для проверки исходной действенной силы сыворотки. Малое количество суспензий он добавил в ячейки всего ряда пластинок. Теперь Хольцер мог определить, до какой степени раствора каждая сыворотка сохраняет или теряет свое действие после смешения с кровью неизвестной группы. Если исходная анти-А-сыворотка, например, оставалась действенной до раствора 1:128, но уже не действовала при растворе 1:16 или 1:32, значит, ее сила уменьшалась в растворе третьей и четвертой степени. Это признак того, что след крови агглютинировал значительное количество анти-А-сыворотки. Если неизменной оставалась действенная сила анти-В-сыворотки, значит, след крови содержит группу А.
После ряда экспериментов Хольцер решил упростить процесс: он не стал сначала проверять анти-А- и анти-В-сыворотку отдельно, потом применять в эксперименте и снова проверять. Вместо этого Хольцер использовал кровь группы 0, содержащую одновременно анти-А- и анти-В-вещества. В октябре и ноябре 1929 г. он провел первый обширный эксперимент на 29 искусственно высушенных следах крови мужчин и женщин, чьи группы крови были заранее известны. Следы содержали 10–15 мг сухой крови. Во всех случаях Хольцеру удалось установить группу крови, причем «вслепую», то есть он не знал заранее, чья это кровь. Результаты вдохновили Хольцера обратиться к Леоне Латтесу и сообщить ему о своих экспериментах. Хольцер попросил Латтеса предоставить ему образцы высохшей крови разного срока давности. Латтес, как всегда, воодушевился. Он прислал Хольцеру семь образцов высохшей крови, группа которых была известна только самому Латтесу. Пять из семи образцов Хольцер определил правильно. Из Вены он получил восемь других образцов и успешно вычислил группу каждого из них. Во время этих экспериментов Хольцер сделал и другие наблюдения и еще больше убедился в надежности своего метода. Самое важное было вот что: ослабление действия сыворотки можно только тогда рассматривать как доказательство определенной группы крови, когда сыворотка проходит множество ступеней разбавления. Одного-единственного разбавления недостаточно, поскольку даже кровь группы 0 может легко ослабить действие сыворотки. Зачастую и кровь группы А в небольшой степени влияет на анти-B-сыворотку. Контрольные эксперименты по методу Латтеса, которые Хольцер проводил параллельно со своими собственными исследованиями, подтвердили, что тест по методу Латтеса не дает таких точных результатов, как метод Хольцера. Однако и метод Хольцера давал сбои: при исследовании 56 образцов крови из Вены ученый ошибся с определением группы крови 13 раз. 11 раз титр анти-А-сыворотки явно снизился, хотя не было ни следа группы! Соответствующие следы крови находились на фильтровальной бумаге. Опять этот вопрос, как при экспериментах Уленгута: ошибки и погрешности возникают оттого, что некоторые несущие поверхности сами поглощают анти-А- или анти-В-сыворотки? Хольцер экспериментально проверил все доступные ему несущие поверхности для следов крови – ткани, бумагу, почву, камни и многое другое. Фильтровальная бумага действительно, как выяснилось, действует на сыворотку крови. Значит, необходимо всякий эксперимент со следами крови предварять анализом несущей поверхности и ее материала, иначе результаты будут недостоверные.